文档介绍：分类号 Q75 学校代码 10129
U D C 577 学号 2009210039

Rab蛋白调控巨噬细胞中TLR9信号转导通路的研究
Research on the Regulation of Rab Protein on the TLR9
Signaling Pathways in Macrophages

申请人:王娜
学科门类:理学
学科专业:生物化学与分子生物学
研究方向:天然免疫的调控
指导教师:王玉珍副教授

论文提交日期:二〇一二年六月
摘要

TLRs 是一类重要的模式识别受体,天然免疫细胞通过识别病原微生物中保守
的病原体相关分子模式,产生细胞因子和趋化因子,启动天然免疫应答,从而构成
了机体免疫反应的第一道防线。然而,TLRs 的活化异常或者过分活化,可能使自身
免疫疾病恶化,产生如系统性红斑狼疮、内毒素休克和自身免疫等疾病。因此,TLRs
信号通路的活化必须得到严密控制。目的:构建 Rab5a 和 Rab9 真核表达载体,建
立稳定表达 Rab5a 及其突变体 Rab5aN133I 的巨噬细胞系,研究 Rab5a 及其突变体、
Rab7 及其突变体过表达后对 CpG 刺激的巨噬细胞中细胞因子的影响。方法:以小鼠
巨噬细胞的 cDNA 为模板,根据 GenBank 中公布的小鼠 Rab5a 和 Rab9 全
长序列设计引物,扩增 Rab5a 和 Rab9 的开放阅读框, 并与真核表达载体
(–)B 连接,转化后挑取阳性克隆,酶切鉴定后测序。通过脂质体法
将 Rab5a 及其突变体 Rab5aN133I 的真核表达载体转染到细胞中,用 G418
选择性培养基进行筛选,建立稳定表达 Rab5a、Rab5aN133I 的细胞系。通过 RT-PCR,
Real time-PCR 和 Western Blot 方法鉴定稳定表达的细胞系。用 CpG 刺激稳定表达
Rab5a、Rab5aN133I、Rab7 及 Rab7T22N 的细胞系 8 小时后检测细胞因子的表达量变
化。结果:将 Rab5a 和 Rab9 的阳性克隆测序后与 GeneBank 中报道序列的同源性为
100%和 99%,均不存在突变。转染 Rab5a 和 Rab7 真核表达载体后 Rab5a
和 Rab7 的表达量明显高于对照质粒转染细胞。Rab5a 过表达后,在 CpG 的刺激作用
下巨噬细胞分泌的 TNF-α、IL-1β和 IFN-β明显升高,而 Rab5aN133I 过表达后
上述细胞因子的分泌均有所恢复。CpG 刺激过表达 Rab7 的细胞,其分泌的 IL-6、
IL-1β及 IFN-β显著降低,而 Rab7T22N 过表达后却促进了上述细胞因子的增殖。
结论:成功构建 Rab5a 和 Rab9 真核表达载体。建立稳定表达 Rab5a、Rab5aN133I
的细胞系。Rab5a 可能是 TLR9 信号通路的正向调控蛋白,而 Rab7 可能是负向调控
TLR9 信号通路的蛋白。本研究为进一步了解 Rab 蛋白在 TLRs 信号转导中的作用奠
定了基础。

关键词:Rab5a;Rab7;Rab9;CpG;TLR9
Research on the Regulation of Rab Protein on the TLR9 Signaling
Pathways in Macrophages

Abstract
Toll-like receptors are important pattern recognition receptors. Cytokines and
kemokines are produced by innate immune cells through identification of
pathogen-associated molecular patterns of pathogenic anisms , and then then
innate immune responses were initiated. Such responses constitute. However, Excessive
immune response has reported to bring adversely affect, such as systemic lupus
erythematosus, endotoxic shock and autoimmune dise