文档介绍：单位及实验室名称项目编号:ASJYK-LAB-C-P-53日期:2015年6月21日版本:第一版,第1次修订第1页,共3页检验科HPV-:明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程,指导检验人员正确进行巨细胞病毒核酸定量的检测。:适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。适合仪器:LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪方法原理:采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术样品要求::实验操作人员应严格按操作规程进行实验。:潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂盒。:阴性、:试剂准备(在试剂准备区操作)(临用前取出,用后立即放回冰箱,反复冻融不可超过三次),取出PCRMIX,室温下避光解冻,上下颠倒混匀后,8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶,8000转/分钟lOs。根据当次实验标本量,取出相应试剂(1管=MIX+DVA聚合酶)总的需求量于一管中(其余随即放回原温度保存),如所需要的管数为n(n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照)取PCR反应管转移至样本制备区。样本处理(在样本处理区进行)~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1)13000转/分钟离心1分钟弃上清,加入细胞保存液重悬细胞13000转/分钟离心1分钟,尽量弃干净上清每样本加入50ul细胞裂解液,充分振荡重悬细胞,煮沸10分钟。13000转/分钟离心10分钟,保留上清备用(上清中为释放的DNA)。取上清作为PCR扩增的模板,其余保存于一20℃在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DVA,空白对照、阳性对照,盖紧管盖,稍做离心(反应总体积为2ou1/人份,每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。转移到检测区,放入相应的荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序PCR扩增(在扩增区操作),再打开计算机电源。,按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;PassiveReference选择none(见表1)ASJYK-LAB-C-P-53第2页,共3页表1:设置四种荧光检测通道DetectorNameTargetReporterDyeQuencherFAM12种高危型HPV(31,33,35,FAMnone39,45,51,52,56,58,5966,68)HEMHPV16HEX/JOEnoneROXHPV18ROX/Red610noneCy5β-globinCy5none将循环条件设定为ProgramCyclesTemperature(℃)IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(℃/sec)AcquisitonModeAnalysisMode119510:00min20NoneNone2459515sec20NoneNone6060secSingleQuantification31385sec20NoneNone检查反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器。将待反应的PCR反应管放