文档介绍：苏州大学
博士学位论文
乳腺癌转移抑制基因BRMS1功能的研究
姓名:朱巍
申请学位级别:博士
专业:放射医学
指导教师:樊赛军
2010-09
乳腺癌转移抑制基因 BRMS1 功能的研究中文摘要
中文摘要
目的:研究乳腺癌转移抑制基因 BRMS1 对乳癌细胞生长、增殖、侵袭、转移
以及辐射敏感性的影响以及涉及的相关作用机制,为研究乳癌的发生、发展和转
移和治疗提供新的研究方向和实验依据。
方法:
1、参照 GeneBank 中 BRMS1 的基因序列,通过自行设计并扩增得到 BRMS1 基
因 cDNA 的引物一对,构建了携带有全长 BRMS1 cDNA 的真核表达载体
(pcDNA3-BRMS1);
2、应用阳离子脂质体 Lipofactamin2000 介导,进行 pcDNA3-BRMS1 转染,阳性
克隆通过在含 G418 的培养基中培养筛选得到,并应用 RT-PCR 和 Western Blot
法检测阳性克隆中 BRMS1 的 mRNA 和蛋白的表达;
3、应用 MTT 法分析 BRMS1 基因转染对体外培养的乳癌细胞生长、增殖的影响;
4、应用划痕实验和 Boyden 小室法,分析 BRMS1 基因转染对体外培养的乳癌细
胞侵袭、转移能力的影响;
5、采用流式细胞术分析 BRMS1 基因转染对细胞周期进程和细胞凋亡的影响;
6、采用裸鼠原位接种肿瘤模型,观察 BRMS1 基因在体内对乳癌生长、转移的影
响;
7、采用裸鼠尾静脉接种肿瘤转移模型观察 BRMS1 基因对体内乳癌转移的影响;
8、通过细胞克隆形成实验分析 BRMS1 基因对乳癌细胞辐射敏感性的影响;
9、采用染色体畸变分析、PCC 断片研究 BRMS1 基因对肿瘤细胞基因组不稳定性
的影响;
10、采用 Western Blot 法检测 BRMS1 基因对 DNA 损伤修复相关蛋白表达水平的
影响;
11、采用 GST-pull down 和免疫共沉淀方法检测 BRMS1 与核受体直接结合;
12、采用荧光素酶报告基因测定方法测定转录活性。
I
中文摘要乳腺癌转移抑制基因 BRMS1 功能的研究
结果:
1、自行构建的 BRMS1 真核表达载体,经过限制性核酸内切酶 BamH I 和 Xho I
酶切后电泳和扩增片断测序,证实载体构建成功;
2、G418 筛选得到的稳定阳性克隆,经 RT-PCR 和 Western Blot 证实,转染 BRMS1
基因可以在乳癌细胞中提高 BRMS 的表达水平,表明高 BRMS1 表达的细胞株
筛选成功;
3、MTT 的结果表明 BRMS1 对乳癌细胞 MDA-MB-231、 MDA-MB-435 的生长无
明显影响;
4、划痕实验结果表明 BRMS1 基因对乳腺癌细胞 MDA-MB-231、 MDA-MB-435
体外迁移能力无明显影响;
5、Boyden 小室实验结果表明:BRMS1 基因转染细胞的穿越细胞数与未转染组相
比显著减少(p<),BRMS1 基因转染细胞的穿越细胞数与空载体组相比
也显著减少(p<);
6、流式细胞术分析结果表明:BRMS1 基因对乳腺癌细胞 MDA-MB-231、
MDA-MB-435 的周期分布及凋亡无明显改变;
7、裸鼠原位接种肿瘤实验结果表明:BRMS1 基因对裸鼠的体重及肿瘤的生长速
度及肿瘤大小无明显影响;BRMS1 基因转染组的原位肿瘤分化程度较高,而
恶性程度偏低;
8、肿瘤转移模型观察:未转染对照组裸鼠有 5 例明显的肺转移,5 例出现肝转移;
转染空载体组裸鼠也出现 5 例肺转移,4 例肝转移,而 BRMS1 转基因裸鼠组
只有 1 例出现肝转移。表明体内 BRMS1 高表达能抑制乳腺癌肿瘤的转移;
9、肿瘤组织血管实验:与未转染组比较,BRMS1 转基因组裸鼠的肿瘤血管数目
较少,有显著统计差异(P<),表明 BRMS1 基因能抑制乳腺癌血管生成;
10、克隆形成实验结果: BRMS1 转染组与未转染组及空载体组的生存曲线基本
一致,表明 BRMS1 基因不影响肿瘤细胞受照射后的存活率;
11、染色体畸变分析、PCC 断片分析结果:不同剂量的 X 射线照射后,BRMS1
转染组的染色体畸变率及 PCC 断片率低于空载体组与未转染组;
12、Western Blot 法检测 DNA 损伤修复相关蛋白表达,BRMS1 基因对辐射修复相
关蛋白 FEN-1、1 和 Ku-70 的表