文档介绍：Biophysics, Peking University School of Basic Medical science
受体研究技术
Techniques in receptor research
韦日生
北京大学医学部生物物理学系
2006年3月
Biophysics, Peking University School of Basic Medical science
第八章组织化学技术在受体定位中的应用
第一节在受体定位中免疫组化的原理和方法
免疫组化的原理
免疫组织化学(Immunohistochemistry)
又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)﹐其主要原理是用标记的抗体对细胞或组织内的相应抗原(受体)进行免疫化学反应,经过组织化学呈色后用显微镜观察受体在组织细胞中的分布和定位。
膜受体或核受体Ag
制备相应的特异性抗体
标记抗体
免疫组织化学测定
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免疫组织化学优缺点
高特异性: 抗原抗体反应是特异性强,识别能力可达到单个氨基酸水平.
高度敏感性: 使用高敏感的和高亲和力的抗体﹐
可检出细胞和组织内超微量的抗原成份。
高分辨能力: 经呈色反应,在受体原位形成有色沉淀或荧光,
其分辨能力远大于放射自显影技术。
免疫组织化学方法唯一的缺点是无法测定受体-配基反应的亲和性(Kd值)
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包括﹕
(受体)提取和纯化抗原可为完整蛋白或一段特异性片段。
(单克隆抗体)。
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6. 免疫组织化学反应和显色。
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免疫组织化学的全部过程
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免疫组织化学标本的制备
抗原(受体)的准确显示和定位与制备的组织和细胞标本质量密切相关
细胞和组织标本的取材
细胞和组织的固定
组织切片
*细胞和组织标本的取材
细胞标本:细胞涂片
组织标本: 取新鲜组织,速冻或立即用固定剂固定.
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保持细胞和组织的原有结构, ,终止和抑制外源性和内源性酶活性,更重要的是最大限度地保存细胞和组织的抗原性及防止抗原的扩散。
*细胞和组织的固定
1 固定剂一般为醛类固定剂和醇类固定剂
醛类固定剂
醛类为交联剂,其作用是交联组织中的氨基,保存抗原于原位。其特点是组织穿透力强,收缩小。常见有:福尔马林, 多聚甲醛等
丙酮及醇类固定剂
该类固定剂为沉淀剂, 其作用是沉淀蛋白质和糖, 组织穿透性很强, 保存抗原的免疫活性较好. 如乙醇,氯仿, 冰醋酸等
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固定组织时应注意:
*力求保持组织新鲜, 勿使其干燥, 尽快固定处理.
*组织块不易过大过厚, 必须小于 2cm x x , 以内.
*固定剂必须有足够的量, 在体积上一般大于组织20倍。
*组织固定后, 应充分水洗, 去除固定剂, 以减少固定剂造成的人为假像.
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载玻片处理
*组织切片
冰冻切片
切片厚度一般为 6μm ,神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm
最突出的优点是能够较好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原(如膜受体).
石蜡切片
其优点是组织结构保存良好, 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值, 能连续切片, 组织结构清晰, 抗原定位准确.
振动切片
用振动切片机(Vibratome) , 对新鲜组织切片, 组织不用固定和冰冻,也没有石蜡包埋.
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