文档介绍：ADissertation inImmunology Establishment ofMosquito AFLP System Candidate: bupervlsor: medical School AnHui University ofScience and Technology ,Shungeng Road,Huainan,23200 1, 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方以外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得塞徵理王太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:j牲日期:礁年』月驾日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塞徽堡王太堂有保留、使用学位论文的规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于塞徵理王太堂。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽理工大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文导师签名勿键签字日期:卿乒年j月>和。签字日期:)渺年上序7日摘要摘要【目的】探讨蚊(Mosquito)扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)的主要影响因素,即DNA模板制备、酶切反应、连接反应、预扩增反应和选择性扩增反应的关键步骤,建立并优化蚊AFLP反应体系。筛选适合AFLP体系进一步研究应用的选择性引物组合【方法】以淡***蚊成蚊为研究材料,用酚.***仿抽提蚊基因组DNA,DU730 检测浓度和纯度,利用线粒体CoiA基因设计引物进行PCR扩增、纯化、测序和Blast比对,从基因水平验证模板来源;酶切反应的37。C温育分为1h、 2h、3h、4h,%琼脂糖凝胶电泳检测;连接反应16℃温育2h、3h、过夜;将不同温育时间的连接产物分别稀释5倍、10倍、20倍,分组进行预扩增反应,% 琼脂糖凝胶电泳检测;将预扩增产物稀释5倍、10倍、20倍进行选择性扩增反应, 以及调整选扩循环数后选择性扩增反应,%琼脂糖凝胶电泳检测。将优化后的 AFLP体系再次扩增,EcoRI的8条上游引物分别与MseI的50条下游引物组合, %琼脂糖凝胶电泳初步选取带型质量好、分辨率高、多态性好的引物组合;荧光标记EcoRI的8条上游引物,将选取的引物组合选择性扩增后经高效毛细管电泳二次筛选适合本研究应用的引物对。【结果】蚊基因组DNA提取效果,OD260/,浓度>400蚓ml, 登录NCBI在GenBank数据库内比对PCR扩增产物的同源性为99%~100%;酶切反应的37"C最适温育时间为3h,弥散带分布均匀;预扩增产物的电泳结果显示, 温育时间长短对连接反应无明显影响,将连接产物稀释10倍是理想的预扩增模板;预扩增产物稀释10倍及25个循环时,可获得清晰的多态性条带。%琼脂糖电泳和高效毛细管电泳筛选出80个引物对,多态性条带有十几条至150条以上。【结论】蚊AFLP反应体系的建立与优化和选择性扩增引物组合的筛选,为进一步研究蚊虫的遗传多样性、遗传图谱的构建和基因定位等方面提供了有力的技术支持。图10表8参55 关键词:蚊;AFLP;反应体系;DNA;酶切反应;连接反应;预扩增反应;选择性扩增反应;CE;引物组合分类号:; 摘要 Abstract Objective To investigate the key factors of Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)system ofmosquito,it contains the critical protocols ofthe preparation with template DNA、restriction endonuclease digestion and ligation ofadapters、pre—amplification and selective AFLP system is established,and optimized least,we also tiltselective AFLP primers optimized fortheadvance study ofAFLP sys