文档介绍：山东农业大学
硕士学位论文
辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)皱缩坏死基因(PcCRN1、
PcCRN2)功能研究
姓名:王和美
申请学位级别:硕士
专业:植物病理学
指导教师:张修国
2011-06-09
山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)是一种普遍存在的土壤兼性寄生菌,在
世界范围内广泛引起辣椒疫病,是严重危害辣椒生产的重要病原之一。世界上种植辣椒
的地区,由于辣椒疫病的发生严重影响了辣椒的产量和质量,造成了巨大的经济损失,
对环境也造成了一定的影响。
近年来,辣椒生产国开展了许多关于抗疫病育种和抗病性分析的研究,对抗病性生
理生化机制,抗病性遗传,抗病基因的定位与克隆以及抗病性鉴定和抗病育种方面进行
了大量研究但是进展缓慢。目前辣椒疫霉的防治还是以化学药剂防治为主,农药残留等
问题仍然给辣椒生产、人类健康和环境安全带来了巨大威胁。因此,寻找探索辣椒疫霉
菌重要的致病因子及其致病机制成为人们研究的重点。
研究表明,在植物病原菌与寄主互作过程中,大多数植物病原会产生一系列调控植
物生化、生理、形态学特征的效应分子来侵染寄主或调节植物的防卫反应。皱缩坏死
(CRN)蛋白就是一类效应分子——胞质效应蛋白,在病原菌与寄主互作过程中通过附
着胞和吸器等特殊的结构进入植物活细胞,调节植物的防卫反应。皱缩坏死(CRN)基
因是 Torto 等人于 2003 年首次在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)胞外蛋白 cDNA
数据库中发现的,其在农杆菌介导的瞬时表达体系中导致本氏烟产生皱缩坏死(crinkling
and necrosis)的症状反应。
CRN 效应蛋白做为一类新的效应蛋白,目前只是在疫霉中发现了这类基因,对这类
基因的研究还不多。在寄主与病原菌互作过程中,皱缩坏死蛋白的致病机制、进入细胞
机制、作用靶标等都不清楚,所以成为人们研究的热点。
本研究以实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株 SD33 为实验材料,对辣椒疫霉中的皱
缩坏死基因进行了以下研究:
(1)根据文献中报道的 CRN 基因的保守序列,我们从辣椒疫霉基因组全序列中筛
选 CRN-like 序列,然后再 NCBI-BLAST 在线比对,确认筛选的基因属于 CRN 基因
家族;
(2)从本实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株基因组中,成功克隆了两个 CRN 基
因,PcCRN1 和 PcCRN2,并在线比对和进行生物信息学分析;
(3)为了了解 PcCRN1 和 PcCRN2 在辣椒疫霉菌中的致病性和保守序列 LQLFLAK
和 WL 在致病中的作用,对两个基因的保守位点进行突变,利用 pGR106 构建 PcCRN1
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辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)皱缩坏死基因(PcCRN1、PcCRN2)的功能研究
和 PcCRN2 及保守位点突变基因的 PVX 表达载体,通过农杆菌介导的瞬时表达进行
体外功能检测;PcCRN1 和 PcCRN2 在农杆菌中瞬时表达后均可产生褪绿症状;这两
个基因保守位点突变前后在本氏烟中瞬时表达也均有差异,说明 PcCRN1 和 PcCRN2
在辣椒疫霉菌中起作用,保守位点的突变对其致病性也有影响;
(4)利用 pHam34 载体构建 PcCRN1 和 PcCRN2 全长基因的沉默载体,通过 PEG
介导的原生质体共转化技术获得 PcCRN1 和 PcCRN2 基因沉默的转化子,通过
RT-PCR 和 qRT-PCR 技术检验并接种验证辣椒疫霉中 CRN 的功能。
通过本研究,我们可以看出 CRN 基因在辣椒疫霉菌的致病过程中起作用,沉默
转化子的成功筛选也证明了 PEG 介导的原生质体共转化技术在 P. capsici 中可以实
施,为辣椒疫霉的分子致病机制研究提供了一种分子生物学技术。
关键词:辣椒疫霉;皱缩坏死蛋白;效应蛋白;农杆菌瞬时表达;突变;基因沉默
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山东农业大学硕士学位论文
Function analysis of crinkling and necrosis genes (PcCRN1
and PcCRN2) from Phytophthora capsici
Abstract
Phytophthora capsici Leonian, a ubiquitous soil facultative parasite, can cause pepper
blight disease