文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
可注射型抗感染组织工程骨治疗兔胫骨感染性骨缺损研究
姓名:边巴罗布
申请学位级别:硕士
专业:外科学(骨科)
指导教师:许建中
2011-05
第三军医大学硕士学位论文
可注射型抗感染组织工程骨治疗兔胫骨感染性
骨缺损研究
摘要
背景和目的:慢性骨髓炎的治疗是骨科临床中治疗的难点。这主要是因为:骨感
染发展成慢性感染后,骨组织及邻近的软组织破坏严重,局部血运差,目前常规的全
身应用抗生素很难在感染局部达到有效的治疗浓度,导致致病菌难以被杀灭;此外,
慢性骨髓炎对骨组织破坏严重,导致骨质硬化和死骨形成,清创后局部残留巨大的骨
组织空腔,由于一期植骨并发再次骨感染而导致移植失败发生率高,目前大多选择二
期植骨,这样就延长了治疗时间,增加了患者的痛苦。但是,伴随着抗生素局部缓释
技术和骨组织工程技术的快速发展,给慢性骨髓炎这一古老而又棘手的疾病的救治带
来了新的希望。我们期望通过以纤维蛋白胶为支架的、复合万古霉素藻酸盐缓释系统
的可注射型组织工程骨来实现在局部的抗感染和促进成骨,从而实现慢性骨髓炎的彻
底治愈。为此,本研究主要目的包括:(1)制备兔慢性骨髓炎模型; (2) 检验以纤维
蛋白胶为支架的、复合万古霉素藻酸盐缓释系统的可注射型组织工程骨的体外生物学
特性; (3)利用已建立的慢性骨髓炎模型检测以纤维蛋白胶为支架的、复合万古霉素
藻酸盐缓释系统的可注射型组织工程骨体内的治疗感染和成骨能力。
方法:(1)通过微创的骨髓穿刺针方法制备兔慢性骨髓炎模型,并通过放射影像
学、组织病理学和细菌学等方法评价骨髓炎模型的科学性和稳定性。(2)通过密度梯度
离心结合贴壁培养法分离、纯化、获得兔骨髓间充质干细胞,通过成骨、成软骨以及
成脂肪诱导分化检测其多方向分化潜能并实现其鉴定。(3)将兔骨髓间充质干细胞通过
逆转录病毒 pLEGFP-N1 标记后,在激光共聚焦下观察标记了增强型绿色荧光蛋白的
间充质干细胞在可注射支架纤维蛋白胶中的分布情况,通过生长曲线和碱性磷酸酶的
检测评价种子细胞间充质干细胞在复合物中的增殖和成骨分化情况。(4)通过已构建的
兔胫骨慢性骨髓炎模型检验复合万古霉素藻酸盐缓释系统的以纤维蛋白胶为支架的可
注射型抗感染组织工程骨在局部的抗感染和成骨能力。再将构建好的慢性骨髓炎模型
感染部位行彻底清创术之后,将可注射型抗感染组织工程骨移植到胫骨干骺端骨缺损
处,通过放射影像学、组织病理学和细菌学检测可注射型抗感染组织工程骨在体内的
抗感染能力和局部成骨能力。
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结果:(1)通过微创的骨髓穿刺针方法建立兔慢性骨髓炎模型,术后 4 周影像学显
示,有明显的慢性骨髓炎的 X 线表现:软组织炎症反应,死骨形成,骨硬化,骨膜反
应,其 X 线 Norden 骨髓炎评分显示,最高分 5 分,最低分 2 分,平均值±标准差为
±。组织病理学显示存在伴有明显骨吸收和死骨形成的化脓性病灶。细菌学结果
提示每只动物近端、中段、远端的骨组织内均培养出 25923 金黄色葡萄球菌,
标本细菌计数的均值为(±)×109CFU/g。(2)通过密度梯度离心结合贴壁培养法分
离、纯化、获得了兔骨髓间充质干细胞,通过成骨、成软骨以及成脂肪诱导液诱导 21
天后经过骨钙素免疫组化染色以及茜素红和 von Kossa 病理染色证实分化为成骨细
胞,通过Ⅱ型胶原免疫组化染色证实分化为软骨细胞,通过油红 O 染色证实分化为脂
肪细胞。(3)用逆转录病毒 pLEGFP-N1 成功标记兔骨髓间充质干细胞,在激光共聚焦
下观察标记了增强型绿色荧光蛋白的间充质干细胞在可注射支架纤维蛋白胶中的均匀
分布,生长曲线和碱性磷酸蛋白酶的检测结果显示种子细胞间充质干细胞可在复合物
中很好的增殖和成骨分化。(4)以纤维蛋白胶为支架的复合万古霉素藻酸盐缓释系统的
可注射型抗感染组织工程骨移植慢性骨髓炎骨缺损模型的感染部位之后,放射影像学
和组织病理学显示复合物可以有效的控制感染,术后 3 月无明显的感染病灶存在,同
时新生的骨小梁较对照组明显;细菌学检测显示实验组的标本内的每克组织内的细菌
数较未放置万古霉素缓释微球的对照组而言显著减少(p<)。
结论:(1)通过改良的方法成功制备了兔慢性骨髓炎模型,降低了感染的不稳定
率及动物的死亡率,该模型具有稳定、科学、重复性好的特点;(2)逆转录病毒介导
的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)成功感染间充质干细胞(BMSCs),激光共聚焦显微镜下
显示种子细胞在支架内均匀分布;(3)生长曲线和碱性磷酸酶的检测显示