文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
荧光HBV病毒体的形态学鉴定及在活细胞中的研究
姓名:姜小瑞
申请学位级别:硕士
专业:内科学(消化内科)
指导教师:林菊生
2011-05
华中科技大学硕士学位论文
荧光 HBV 病毒体的形态学鉴定及在活细胞中的研究
华中科技大学同济医学附属同济医院肝病研究所
硕士研究生:姜小瑞
导师:林菊生
摘要
【目的】:制备双砷染料标记的荧光乙型肝炎病毒(hepatits B virus,HBV)体,对其形
态学进行鉴定分析,并动态观察 HBV 荧光体在活细胞中的生物学行为。
【方法】:采用脂质体介导的方法,将已成功构建带有 TC 标签的 倍乙型肝炎病毒
基因组的载体质粒(-mTC1)瞬时转染入人肝癌细胞株中,该重组载体是
通过 PCR 定点基因突变技术将一个能与双砷荧光染料特异性结合的 TC 标签
(C-C-P-G-C-C)在基因水平上插入到 HBV 核心蛋白免疫主区 c/el 位点。48h 后通过间
接免疫荧光检测表面抗原在细胞内的表达与分布;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测
细胞培养上清液中乙肝表面抗原(HBsAg)的表达;同时收集转染细胞上清液,经不连
续蔗糖密度梯度离心进行分离和纯化后,加抗体孵育进行免疫电镜观察分析,同等培
养条件下 HepG2 细胞和 细胞培养上清液分别作为阴性和阳性对照。活细胞研
究中,我们应用 Oregon Green ® 488 Taxol 标记微管骨架后,在活细胞时差共聚焦显
微镜下观察荧光 HBV 病毒体在宿主细胞中的运输过程。
【结果】:间接免疫荧光结果显示在转染 -mTC1 组细胞中双砷的红色荧光
强于转染 细胞组,呈典型的核浆型分布。电镜结果显示,转染
组细胞在 48h 时可表达 HBsAg 并可自行组装成 12nm 左右的球形颗粒后分泌至上清
中,而阴性对照组和 -mTC1 组未见到与文献报道一致的 HBV 颗粒样结构。
活细胞时差共聚焦显微镜观察显示荧光 HBV 颗粒感染 HepG2 细胞后约 3h 荧光颗粒
开始吸附并侵入胞内,约 5h 时在胞浆中富集而少数已到达核周,并可观察到荧光 HBV
颗粒依赖于微管的运动。初步证实重组的 HBV 荧光体同野生型 HBV 一样保留了抗原
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性和感染性。
【结论】:TC 嵌合型核心蛋白在转染 -mTC1 细胞中能够特异性的发出荧光,
且 TC 标签的插入并不影响表面抗原及核心蛋白的表达。双砷复合物这一新颖荧光标
记技术使得 HBV 在活细胞中的示踪观察成为可能。在深入研究 HBV 荧光体在胞浆中
运输的动态过程及与宿主细胞间的相互关系方面,可作为一种高度有价值的研究工
具。
【关键词】乙型肝炎病毒;双砷染色;免疫电镜;活细胞示踪
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华中科技大学硕士学位论文
Morphological identification and live-cell observation of
fluorescent hepatitis B virus particles
Institude of Lver Disease,Tongji Hospital,Tongji Medical College,HuaZhong
University of Science and Technology
Postgraduate:Jiang Xiaorui
Tutor :Lin Jusheng
Abstract
【Objective】To generate binant HBV fluorescently labeled with biarsenical dye and
analyze its morphological charateristics,and to observe its biological behavior in living
cells.
【 Methods 】 A human hepatoblastoma cell line was transfected by liposome with
-mTC1,a vector that has been essfully prepared by insertion of a TC-tag into
plasmid -overlength