文档介绍：HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定
【摘要】目的:建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库,并从中克隆鉴定出新的应答基因. 方法:分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA,用SMART PCR技术合成全长双链cDNA,经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组,分别衔接两个不同的接头,再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR,将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,挑取克隆进行筛选排除假阳性,再行序列分析,鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因. 结果:成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库,得到158个白色的克隆,随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个,长约100~400 bp,经筛选后得到70个克隆,测序表明有16个差异表达的基因,其中可能的新基因有5个. 结论:用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库,为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础,初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.
【关键词】 HBV 胎肝细胞杂交消减文库克隆
0引言
慢性乙型肝炎易形成长期免疫耐受和复杂疾病谱,从HBsAg携带、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等,宿主对病毒的反应在发病机制中起重要作用. HBV与宿主相互作用不仅仅发生在细胞表面,很可能是一个非常复杂的相互作用网络,HBV与宿主组织细胞之间这种特定的相互作用决定着病毒的存活与疾病的发生、发展及转归,而这种相互作用反映在基因水平上则表现为病毒感染后宿主细胞基因表达谱的改变. 完整的HBV感染肝细胞基因表达谱的研究有可能使我们更深入地认识HBV的分子致病机制,从而发现更多、更有效的抗病毒作用靶标. 本研究我们用抑制性消减杂交技术克隆并鉴定HBV感染胎肝细胞后的应答基因,为阐明HBV宫内感染的分子机制奠定基础.
1材料和方法
, 胎牛血清购自Highclone公司,总RNA提取试剂盒购自Promega公司,SMART PCR cDNA合成试剂盒、 PCRSelect cDNA消减杂交试剂盒、Advantage2 cDNA PCR试剂盒、PCRSelect Differential Screening试剂盒、NucleoTrap PCR纯化试剂盒及尼龙膜、单面乳胶胶片均购自Clontech公司,[α32P] dATP购自北京福瑞生物工程公司核酸研究室.

[1-2]用纤维连接素包被培养皿,将冻存的22 wk人胎肝细胞复苏,加入经过纯化的人血清来源的HBVDNA病毒,cDNA同时阳性的胎肝细胞做为感染组,同时培养的未感染细胞做为阴性对照组,收集细胞进行后续的实验.
,按说明书操作并进行定性定量分析. 用SMART PCR cDNA合成试剂盒合成长距离ds cDNA,按说明书操作,用CHROMA SPIN
1000进行纯化,按说明书操作. 取36 μL Rsa μL Rsa I酶( nkat)