文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
RNAi沉默ADAMs家族基因对肿瘤细胞生物学活性的影响
姓名:丰菁
申请学位级别:硕士
专业:医学遗传学
指导教师:唐艳平
20090501
华中科技大学硕士学位论文

第一部分
RNAi 沉默 ADAM17 基因对多种肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨 RNA干扰技术沉默ADAM17基因表达在肿瘤细胞增殖和凋亡中的影响,以其
为研究靶标,为对抗肿瘤的基因治疗提供潜在的依据和手段。
方法:采用小发夹结构RNA ( shRNA) 介导的RNA干扰技术,利用本实验室已构建好的
ADAM17干扰载体pGensil-1-TACE,用脂质体介导重组真核干扰载体转染四株肿瘤细胞
(Hela,HepG2,SGC-7901,MCF-7),建立瞬时转录系统,观察转染后绿色荧光蛋白
EGFP的表达情况评估转染效率。培养一周并观察其对肿瘤细胞生长状态的影响,采用
Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FACS)检测转染重组干扰质粒后细胞的凋亡状况。
MTT比色法测定细胞增殖的抑制,观察转染前后各组肿瘤细胞增殖能力的变化。
结果:干扰真核表达载体成功转入四株肿瘤细胞,荧光显微镜观察其转染效率,其在24h
时转染率高达80%。MTT检测显示,沉默细胞增殖能力与阴性质粒对照组和空白对照组
相比显著降低(P<);细胞凋亡百分率在48h时shRNA干扰组(±%)
明显高于阴性质粒对照组(±)%和空白对照组(±)%,差异有统计学意义
(P<)。可见ADAM17基因沉默后,各组肿瘤细胞增殖能力明显降低并诱导凋亡。
结论:ADAM17基因沉默对肿瘤细胞的增殖和凋亡均产生了一定的影响。即有效地抑制
了肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。从而为研制和开发肿瘤基因治疗的药物和途径开辟了
新思路。
关键词:ADAM17 基因;RNA 干扰;肿瘤细胞(Hela,HepG2,SGC-7901,MCF-7);
增殖;凋亡
第二部分
小分子 RNA 干扰片段阻遏小鼠神经母
细胞瘤 N2a 细胞中 ADAM10 及其前体蛋白酶 PC7 基因的表达
目的:探讨靶向ADAM10及其前体蛋白酶PC7基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,
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shRNA)对N2a细胞中目的基因的沉默效应,即是否能抑制靶基因在哺乳动物肿瘤细胞中
目的基因的表达,为进一步利用RNA干扰技术对抗肿瘤的基因治疗提供新的依据和手段。
方法:利用DNA重组技术针对ADAM10和PC7基因的shRNA序列克隆到pGensil-1中,构
建shRNA真核表达载体,通过酶切和测序等方法进行鉴定。用脂质体介导法将已构建好
的重组干扰质粒转染入小鼠神经母细胞瘤N2a细胞株,免疫荧光检测转染效率,采用半
定量RT-PCR和Western免疫印迹法分别从mRNA和蛋白质水平检测转染前后目的基因的
表达,以及小鼠脑内注射重组干扰质粒pGensil-1-PC7后,在体观察局部转染后绿色荧光
的表达,以了解RNA干扰效果。
结果:成功构建了真核干扰载体pGensil-1-ADAM10,pGensil-1-PC7;免疫荧光结果显
示外源性干扰质粒在神经母细胞瘤N2a细胞中获得瞬时表达,基因转染和表达率可达
90%;两目的基因mRNA相对水平(与内参的灰度比值):±、
±0. 05,阴性对照转染组分别为1. 25 ±0. 07、1. 27±0. 08,shRNA重组质粒转染组分
别为0. 35 ±0. 03、0. 62 ±0. 05,可见shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低
(P<)。细胞中目的基因的蛋白水平变化趋势与mRNA表达相似。灰度扫描曝光检
测显示实验组重组干扰质粒成功转染入小鼠体内有较强绿色荧光的表达,与对照组具有
显著差异性。
结论:我们构建的shRNA干扰载体能有效沉默小鼠N2a细胞中靶基因的转录和表达,从
而可能抑制肿瘤细胞的增殖促其凋亡,为下一步在动物体内利用重组干扰质粒沉默目的
基因的表达提供实验基础。
关键词:短发夹状RNA;ADAM10;N2a细胞株;基因干扰

综上所述,研究证实应用短发夹状RNA介导的干扰技术对肿瘤细胞可以取得明显干
涉效果,进一步完善RNA干扰实验来抑制肿瘤细胞生长是存在可能的。由于ADAM家族
基因(ADAM17,ADAM10,PC7)在肿瘤细胞中可能均具有显著的抑制效应,但作用
机制尚不明确。因此将有可能成为肿瘤治疗潜在的