文档介绍：安徽农业大学
博士学位论文
球孢白僵菌抗逆相关功能基因克隆与基因工程菌株构建研究
姓名:谢翎
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:李增智;黄勃
20090601
球孢白僵茵抗逆相关功能基因克隆与基因工程菌株构建研究摘要酶基因枷的序列登录号分别为:和2⑼虫生真菌作为重要的天敌生物资源,具有广阔的应用前景,尤其是其可贵的流行潜力始终吸引着人们。球孢白僵菌韵录虺瓢捉┚是害虫微生物防治中一种经典的丝孢类虫生真菌,可侵染个目隹频多种昆虫和若干种蛛螨类。在自然界中它具有分布广、感染力强和扩散流行的特点;同时也具有不污染环境,易于培养,以及防治效果好等优点。因此白僵菌也是研究最多、应用最广和最具有开发潜力的虫生真菌。然而,如同其他真菌杀虫剂一样,球孢白僵菌因为击倒害虫时间长、防效不稳定以及自身抗逆性较差等缺点,目前在农药市场上的占有率依然很低。为延长白僵菌孢子储藏期,增强其环境稳定性,有必要利用基因工程手段对其进行改造,以获得适合市场需要的产品,促进其商品化生产和应用。海藻糖是广泛存在于各种生物体内的抗逆境剂,具有增强生物体对高温、脱水、干旱、冷冻、高渗透性、重金属及有毒物质等逆境的抵抗能力。胞内海藻糖积累与丝状真菌孢子的储藏期延长密切相关。我们推测,通过基因工程技术改变球孢白僵菌体内海藻糖代访揪叮梢蕴岣哝咦幽诤T逄呛浚黾悠淇鼓婺芰Α同样,具有保护细胞功能的热休克蛋白是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员。它的研究已成为目前生命科学领域研究的热点之一。鞍鬃魑R恢址特异性保护蛋白,能够防止蛋白质变性和帮助已变性的蛋白重新折叠,恢复正确的构象,具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡等独特复杂的生物学功能。因此,对于细胞的生存起着至关重要的作用。通过克隆球孢自僵菌颍⑸钊胩教制浔泶规律和作用机理对虫生真菌抗逆机制研究具有重要的意义。技术从球孢白僵菌曛锌寺×撕T逄合成途径中的两个重要基因T逄且一磷酸合成酶基因和海藻糖一姿崃姿狨过揭萍际趸竦昧怂歉髯缘纳嫌纹舳有蛄锹己牛篎P蛄蟹治霰砻鳎呵蜴甙捉┚鷗峁够蚝幸桓龀ざ任哪诤樱位于结构基因的罨碱基处。其全序列为。开放式阅读框由个核苷酸组成,编码霭被幔墒斓鞍桌砺鄯肿恿课砺等电点为’非翻译区与环欠肭分别为。在终止密码子下游有游残藕臕陀孢白僵菌基因上游序列的转录起始位点位于第位罨Α8蒙嫌涡蛄泻我们通过的峁埂G安徽农业大学博士学位论文球孢白僵菌抗逆相关功能基因克隆与基因工程菌株构建研究
分子量为.,理论等电点为’非翻译区’一们限’.非翻译区’一分别为。在终止密码子下游含有的峁埂G蜴甙捉┚有—猙,同时也存在其它多个潜在转录因子结合位点。如:.合位点,结合位点,结合位点以及可与Ⅳ型锌指蛋白B家蜃相结合的元件等。球孢白僵菌结构基因含有两个长度分别为的内含子。它们分别位于结构基因的罨碱基处和碱基至碱基处。它们均符合真核生物内含予剪接位点瑼’规则。的全序列为。开放式阅读框由个核苷酸组成,编码霭被幔墒斓鞍桌砺基因上游序列的转录起始位点位于第位罨Α8蒙嫌涡蛄泻蠺和—⑶乙泊嬖谄渌喔銮痹谧B家蜃咏岷衔坏恪H纾篶结合位点,Ⅳ型锌指蛋白B家蜃相结合的元件含量相当高。使用同样方法,我们从球孢白僵菌中克隆出了完整的热休克蛋白虮码区序列及上游序列。该基因全长,朔欠肭,朔欠区7旁亩量,编码霭被帷3墒斓鞍桌砺鄯肿恿课.,理论等电点为5玫降纳嫌涡蛄谐ざ渲杏序列与序列重叠。分析表明,该上游序列的转录起始位点位于第位罨Γ挥忻显的—虲ê蠧因子结合位点,以及热激应答元件虶<绕舳铀呈降骺卦<通过。际酰颐嵌郧蜴甙捉┚鷗蚳基因在高温、低温、紫外照射等不同胁迫条件下的转录情况进行了检测。从转录水平探讨了不同胁迫条件对球孢白僵菌这两个基因表达的影响。结果表明,球孢白僵菌菌丝与孢子中的基因在三种胁迫下转录表达差异较小。而三种胁迫均能诱导球孢白僵菌热休克蛋白基因目焖俑咝ёB急泶铩K得髑蜴甙捉┚衪雋基因,对于外界逆境影响,具有不同的应答机制。将克隆得到的球孢白僵菌基因连接到分泌性表达载体上后,通过电转化,转入毕赤酵母>状加盏蓟竦昧左右的表达蛋白,与预测的结果及相关报道结果接近。同时,酶活测定结果表明,表达蛋白具有海藻糖一涣姿岷铣擅干锘钚裕盏嫉拇置敢好富钭罡叽锏./。将克隆得到的球孢白僵菌基因连接到含有构巢曲霉涣姿岣视腿┩亚饷富启动子的载体后,通过芽孢转化,重新转入球孢白僵菌中,对该基因进行组成型表达。抗逆性评价表明基因的组成型表达,在低温下可一定程度增强重组菌株的贮藏性能,相对于出发菌株,重组菌株的活孢率同比提高了约%。在一定热胁迫范围内,重组菌株耐热性能也得到了提高,相对于出发菌株,重组菌株的活孢率、等重要的转录安徽农业大学博士学位论文球孢白僵菌抗逆相关功能基因克隆与基因工程菌株构建研究