重组蛋白制备资料.ppt

文档介绍：如何获得重组蛋白?
重组蛋白制备
●重组表达载体构建
●目标蛋白重组表达
●最高效的蛋白分离纯化方法—亲合纯化
基因克隆
基因克隆( Gene cloning)
亦称分子克隆技术。将某特定基因或DNA
片段插入到载体分子中,并筛选获得纯化
(克隆)重组子的技术。
基因克隆程序
1)目的基因片段获得
2)目的载体的获得
3)目的基因与载体DNA的限制性酶切
4)酶切目的基因与载体DN***段的连接重组
5)连接重组质粒转化大肠杆菌
6)含目的基因插入片段的重组子鉴定
重组蛋白表达载体构建
PCR扩增
在大肠杆菌
中扩增质粒
目的基因片段
pET28a表达载体
Ndel、BamH
双酶切
Ndel、BamH
双酶切
带粘性末端的目的基因片段
带粘性末端的表达载体
T4DNA连接酶
基因克隆所需通用材料
需要克隆的目的DN***段。
克隆载体,用于接入目的DN***段。
限制性内切核酸醯,消化目的DN***段与克隆载
体,产生连接反应所需要的DNA粘性未端。
●DNA连接醢,将目的DN***段与克隆载体连接在
一起,构建重组载体。
大肠杆菌感受态细胞,用于筛选含有插入目的
DN***段的阳性克隆
基因克隆流程图
限刮性内订蔚
试剂盒
H的基因PCR片段
纯化
限制性内切
pUC8质粒
pUc质粒
重組pUc质粒
转化大肠杆菌
度培养
质粒抽是
DH5a
阳性克隆
、目的基因片段获取
1)聚合酶链式反应—PCR
2)反转录-聚合酶链式反应—RT-PCR
PCR
PCR:
Pol ymerase cha in Reaction
多聚酶链式反应
美国 Kary b. Mullis1985年建立
(1993诺贝尔化学奖获得者)