文档介绍：安徽医科大学
硕士学位论文
<'18>F-FDG对HepG2肝癌细胞增殖与凋亡影响的初步研究
姓名:司原
申请学位级别:硕士
专业:放射医学
指导教师:王明明
20100501
安徽医科大学硕士学位论文
18F-FDG对HepG2肝癌细胞增殖抑制与
凋亡影响的初步研究
摘要
临床肿瘤放射治疗主要采用外照射治疗,但其会在射线杀伤肿瘤细胞的同时
损伤周围正常细胞。因此,科学家一直在探索如何提高肿瘤放射治疗效果并同时
降低射线对周围正常组织损伤的方法。1946年Na131I首次用于甲状腺癌治疗以来,
负电子内照射治疗肿瘤已有60多年。就电离辐射损伤效应而言,正电子与负电子
均可直接间接杀伤肿瘤细胞。近年来人们逐步开展正电子治疗肿瘤的研究工作,
目前以18氟-氟代脱氧葡萄糖(18F-2-Deoxy-2-Fluoro-D-Glucose, 18F- FDG)为代表的
正电子放射性药物在临床上广泛用于PET显像。研究证实,短半衰期的18F衰变,
发射正电子,-,通过湮没辐射产生γ射线,可进行PET显像,
而且可以对高度摄取18F-FDG的恶性肿瘤进行放射治疗。我国是肝癌的高发地区。
近年发病率呈缓慢上升趋势,病死率也随之上升,占癌症死亡率的第三位。肝癌
的治疗方法非常多,但肝癌是各种实体肿瘤中预后最差的恶性肿瘤之一,接受治
疗的肝癌病人5年生存率仅14%—30%,故有必要寻找新的肝癌治疗方法。由于肝
癌原发灶及转移灶可以高度选择性地摄取18F-FDG,肿瘤恶性程度越高,细胞代谢
越旺盛,对18F-FDG的摄取率就越高,治疗效果就越好。
目的:本课题从细胞受照后形态变化、细胞增殖、细胞凋亡、活性氧产量、相关
基因表达等方面,探讨不同放射性活度18F-FDG对HepG2肝癌细胞的影响,探讨
18F-FDG抑制HepG2肝癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡的可能机制。为将来利用正电
子放射性药物内照射治疗肝癌原发灶和转移灶提供实验依据。
方法:( 1)细胞培养:将HepG2肝癌细胞接种于含 10%小牛血清的DMEM
培养基中,37℃、5%CO2传代培养。(2)细胞照射:取对数生长期细胞,于传
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代24h后分别加入18F-×107 Bq /mL、×107 Bq /mL、
×107 Bq/mL,对照组仅加入等体积的DMEM完全培养基,照后24h分别进行实
验。(3)细胞形态观察取各照射组及对照组细胞后,普通倒置显微镜观察细胞形态
变化,照相。(4)MTT法测定细胞增殖:取对数生长期细胞,胰酶消化,调成细
胞浓度为1×105/ml的悬液,接种于96孔板,每孔100ul,加 100ul完全培养基,培养24h。
照射组每孔加18F-FDG,使其活度浓度为实验设定浓度。空白孔加同体积培养基。
加18F-FDG6、12、24h后每孔加20ul浓度为5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h后弃培
养基,每孔加入DMSO 150ul,震荡10min,在酶标仪上检测测各孔的OD值(波长
570nm)。计算细胞增殖的抑制率。(5)细胞凋亡率的检测:%胰蛋
白酶消化、培养液制成单细胞悬液,计数活细胞并调整细胞浓度5×105/ml。离心收
集细胞,PBS洗涤,-20℃预冷的70%乙醇固定1h后,PBS洗涤,用5mg/mlRNA酶
在37℃孵育30min,以10µg/ml碘化丙啶(Propidium iodide, PI)溶液染色,避光反应
15min,流式细胞仪检测。(6)细胞内活性氧的测定:18F-FDG处理细胞6h
后,PBS洗涤2次,分别加入150µl 20µmol/L DCFH-DA工作液,在CO2培养箱内37℃
孵育30min,PBS洗涤3次后,以流式细胞仪在激发光波长485 nm,发射光波长538nm
处检测细胞荧光强度,每个样本计数10000个细胞, 以WinMDI软件分析平均荧光强
度(mean fluorescent intensity, MFI)。(7)RT-PCR检测P53基因,rad51基因表达:细
胞加18F-FDG 24小时后,抽提总RNA:具体步骤见Trizol总RNA抽提试剂盒说明书。
提取的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应。反应产物在凝胶中以100V电泳后于凝胶
成像仪中观察拍照,经Bandscan软件进行半定量分析,将测出各条带灰度值除以
β-actin 的灰度值,得到一相对强度(relative intensity ,RI),通过各浓度组的RI值比较
可得出基因表达的变化规律。(8