文档介绍：福建医科大学
硕士学位论文
MEKK3在LPS刺激后恶性肿瘤细胞产生IL-6作用中的初步研究
姓名:钱凤英
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:黄俏佳
2011-03
MEKK3 在 LPS 刺激后恶性肿瘤细胞产生 IL-6 作用中
的初步研究
摘要
随着科学的进步,临床综合治疗,包括新辅助放、化疗及生物治疗,基因
疗法以及传统医学在治疗肿瘤方面已取得惊人进步,但从总体上看,目前多数恶
性肿瘤的治疗效果及预后仍不佳,患者的 5 年生存率仍然很低。恶性肿瘤的发生
与发展是多种因素影响的结果、长期的慢性炎症是胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、
前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等的重要致病因素,而细胞因子在此过程中发挥重要
的作用。研究已证明,肿瘤细胞接受致炎因子(TNF-α、LPS 等)刺激后产生的
大量细胞因子白细胞介素-6(IL-6),与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及抵抗化
疗作用等预后不良密切相关。在查阅大量文献和原有工作的基础上,本研究应用
RNA 干涉(siRNA)、基因克隆、基因转染、重组腺病毒、Western blot、RT-PCR
和 ELISA 技术,探讨有丝分裂原激活的蛋白激酶 MEKK3 在 LPS 刺激后的恶性
肿瘤细胞所产生的 IL-6 中的作用,旨在为阐明恶性肿瘤细胞中 LPS 介导的 IL-6
产生的机制和发现可能的治疗药物作用的靶点奠定基础。
卵巢癌、肺癌是高度恶性的肿瘤,而胃癌和乳腺癌则是我国或女性中最为
常见的恶性肿瘤,我们首先应用 LPS 刺激这四种不同肿瘤细胞,检测其 IL-6 的
产生水平,发现四种细胞均能产生不同浓度的 IL-6,但以卵巢癌 SKOV3 和胃腺
癌 AGS 产生的浓度较高,因此,选择 SKOV3 和 AGS 细胞进行研究。
本研究第一部分首先应用 ELISA 方法检测胃腺癌 AGS 细胞和卵巢癌
SKOV3 细胞接受 LPS 刺激后 IL-6 的产生。结果表明:在接受 LPS 刺激后,AGS
细胞和 SKOV3 细胞均能产生较高水平的 IL-6。在此基础上,应用 RT-PCR 方法
分别检测 AGS 细胞和 SKOV3 细胞接受 LPS 刺激后 MEKK3 基因表达的改变,
以判断其是否是 LPS 信号途径的成分。RT-PCR 结果显示:与未刺激的样本对比,
两种细胞接受 LPS 刺激后,MEKK3mRNA 表达均明显增加。RT-PCR 结果表明:
MEKK3 可被 LPS 激活、MEKK3 是 LPS 信号途径的信号分子,其接受 LPS 刺激
后其 mRNA 表达的改变相似于文献报道的其他蛋白激酶因接受细胞因子刺激而
活化后的基因表达的改变。
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以第一部分的结果为依据,本研究的第二、三部分着眼于探讨 MEKK3 是
否参与 LPS 刺激后恶性肿瘤细胞所产生的 IL-6 的调控。
本研究第二部分应用 Genscript 公司 siRNA 设计软件设计针对 MEKK3 基因
编码区 3 个不同部位 siRNA 靶点、MEKK2 基因编码区(因与 MEKK3 基因具有
较高同源性,作为判断 MEKK3 发挥作用是否特异的对照)3 个不同部位 siRNA
靶点及阴性对照 siRNA 靶点的模板 DNA 序列,合成与 siRNA 相应的 DNA 片段,以MluⅠ
及XhoⅠ克隆入 pRNAT- 腺病毒穿梭载体,将 siRNA 穿梭载体线性化后
与骨架载体 pADEasy-1 在 BJ5183 菌中同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒
质粒,以脂质体转染 293A 细胞包装形成具有感染能力的重组腺病毒颗粒,重组
腺病毒在 293A 细胞中扩增。重组腺病毒颗粒扩增 3-5 个循环后进行病毒滴度和
感染活力的测定。利用腺病毒质粒中所带绿色荧光蛋白(Green fluorescence
protein,GFP)报告基因来验证转染成功。具有感染能力的 MEKK3 siRNA、MEKK2
siRNA 和阴性对照重组腺病毒颗粒感染(转导)SKOV3 和 AGS 细胞,Western-blot 检
测并筛选出 MEKK3 和 MEKK2 蛋白表达最低的细胞株。结果发现,三个 MEKK3
siRNA 表达载体对 MEKK3 的表达均有抑制作用,其中 pAdEasy-1-pRNAT-
deno-MEKK3siRNA3(简称 AD-MEKK3-siRNA3)的抑制作用最为显著,抑制率
达 89%。三个 MEKK2siRNA 表达载体对 MEKK2 的表达均有抑制作用,其中
pAdEasy-1-pRNAT--MEKK