文档介绍：河北医科大学
硕士学位论文
CVB3VP1蛋白与重组腺病毒及重组质粒联合应用的免疫效果
姓名:田新利
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:王永祥;金玉怀
20090301
鞍子胫刈橄俨《炯爸刈橹柿联合应用的免疫效果摘要目的:柯萨奇病毒型腥舅碌牟《拘孕募⊙籽现匚:θ死嘟】担彩新生儿猝死的重要原因,迄今尚无有效的预防方法。的主要衣壳蛋白,可诱导机体产生免疫应答。研究表明,编码腄疫苗能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并对小鼠有一定的保护能力,但不能有效阻止致死量病毒感染。目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中,复制缺陷型腺病毒载体系统以其广泛的宿主范围、极高的转染效率、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点,在疫苗载体选择中表现出优势,成为极具应用前景的基因转移载体。但由于腺病毒载体自身免疫原性较强,对自身抗原产生免疫应答而不能多次应用。蛋白质有很强的免疫原性,免疫动物可诱导产生高效价的抗体。从病原体中提取具有免疫保护作用的蛋白,或利用刈榧际跏怪刈樘灞泶锏鞍住⒍嚯幕蚝铣呻闹瞥傻囊苗,称为亚单位疫苗。亚单位疫苗不含感染性组分,无须灭活,也无致病性。但也有研究表明,某些病原体亚单位疫苗的免疫原性低,不能达到满意的免疫保护作用。近年有研究显示,采用産方法将不同疫苗联合中文摘要
醇沉淀法进行纯化。ū臼仪捌诠菇ǖ腁痸第三代病应用能明显提高免疫效果。本研究采用産方法将重组腺病毒/隒疺呙缁駽鞍滓呙缌:嫌τ妹庖咝∈螅鄄烀庖咝Ч方法:沂仪捌诠菇ǖ脑吮泶镏柿/转入表达宿主菌盏急泶镄×标签的鞍祝直鹄肏单抗和多抗经産ㄎ尬蠛蠖阅康牡鞍捉杏呕泶铩=ù罅坑导表达的菌体在冰浴中超声破碎,分离上清和包涵体沉淀,对该蛋白的水溶性进行分析。将包涵体溶液经金属镍离子基质亲和层析柱纯化,获得纯化的蛋白。眉盍呀夥ù幼;的大肠杆菌中大量提取质粒/镁垡叶毒液感染赴鹑展鄄煜赴”洌サ南赴鱿病变后,收集细胞和培养液,用腺病毒沉淀法纯化试剂盒纯化。锸笛椋航~芰湫坌訠痗小鼠随机分为组,每组弧7直鹞椋肌肉注射周危次;柿W椋杭∪庾射/周危次;俨《咀椋杭肉注射/周危次:柿#俨《咀椋第次注射/次注射/鞔渭隔埽腺病毒/质粒组:第巫⑸銩痸,第次注射/鞔渭涓周;鞍祝俨《咀椋第次注射鞍祝次注射/鞔渭涓周;俨《荆鞍鬃椋旱次注射/、巫射鞍祝鞔渭涓周;鞍鬃椋好周注射次,共巍V柿2捎霉伤耐芳〗又郑又智白⑸ジ呱中文摘要
:.;腺病毒组.,蔗糖溶液后原位注射质粒籚蛋白以∈秃螅捎眉∪庾⑸涿庖撸看谓又/只。初次免疫用完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂;重组腺病毒/訮稀释,每次肌肉接种只。每次免疫后第天,内眦静脉取血,分离血清,用微量中和试验检测血清特异性中和抗体,用觳固澹坏谌蚊庖吆周,每组恍∈笕∑⒃嘀票噶巴细胞悬液,采用细胞计数试剂盒法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性馨拖胞,,观察并记录小鼠死亡情况至感染后第天;每组剩余的恍∈笥琽攻击,注射病毒后第觳裳#舛ㄑV胁《镜度。结果:盖屑ń峁な党晒μ崛×苏婧吮泶镏刈质粒/在大肠杆菌中成功表达了鞍祝泶锏鞍字饕R园逍问酱嬖凇细胞大量扩增了重组腺病毒并进行了纯化。看免疫后天,取血,测各组血清中和抗体的平均效价分别为:哉兆槲醇觳獾剑籶疺质粒组.,恢柿#俨毒组.,:.;腺病毒/质粒组.,坏鞍祝俨《咀::.,幌俨《荆蛋白组.,5ヒ蛩胤讲罘治霰砻鳎齈对照组外,其余各组中和抗体滴度逐次增;第三次免疫后,蛋白组中,蛋白组.,:.;中文摘要
次免疫后,蛋镮抗体滴度高于椤⑾俨《咀椤组各次效价均低于恢柿W:,,;腺病毒组:恢柿#俨《咀:,,白组和腺病毒/质粒组生存率为%;腺病毒组和质粒组生和抗体滴度高于质粒/楹拖俨《#篜腺病毒/质粒组::;蛋俨《咀:,:腺病毒/蛋白组:,;蛋白组,,。单因素方差分析表明,除对照组外,其余各组固宓味戎鸫卧黾;第三质粒/椤⒌鞍祝俨《咀椤⑾俨《#俨《咀榭固宓味纫哺哂谥柿疺组。∈笃⒃嗔馨拖赴鲋呈匝榉直鹨訡偷抖沟珻体外刺激淋巴细胞,检测细胞增殖活性。单因素方差分析表明,蛋白参与各组的增殖活性均显著高于楹椭柿W閒。匾煨訡杀伤活性经单因素方差分析表明,质粒/腺病毒组、腺病毒/质粒组、蛋俨《咀椤⑾俨《荆鞍鬃椤⒌鞍鬃樾∈蟮腃特异性杀伤率明显高于;.セ餍∈螅组天生存率分别为:蛋白组生存率达%;质粒/腺病毒组生存率为%;蛋俨《咀樯媛饰ィ幌俨《荆存率为ィ籔组无存活。,,蛋白组、质粒/∈笱V胁中文摘要
《咀椤⑾俨《荆鞍鬃