文档介绍：内蒙古医学院
硕士学位论文
Myo5a特异性片段克隆、原核表达及蛋白纯化
姓名:游荷花
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:沈敬华;额尔敦
20100501
中文摘要目的构建一一疢原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,并对该重组蛋白进行纯化。方法采用多聚酶链式反应┰龀鏊母鯩基因特异性片段的蛋白编码序列,经盖泻螅尾迦朐吮泶镌靥錺一一菇ㄖ刈樽覲/>拗菩悦盖小和测序验证正确后,转化至大肠杆菌感受态细胞,经毂虼籶—肴樘擒彰诱导重组蛋白表达。—电泳、分析证实蛋白表达的特异性。结果经限制性酶切、筒庑蚣ㄖ实原核重组载体一一疢构建成功,经诱导重组蛋白表达后,电泳证明表达产物相对分子量为左右,证实该蛋白具有免疫反应特异性,通过亲和层析法对蛋白进行了纯化,获得了一一疢融合蛋白的纯品。结论构建了一一疢原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达了疢融合蛋白。。关键词一一疢原核表达表达蛋白蛋白纯化。蚗
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匾煨云慰寺⒃吮泶锛暗鞍状炕∏虻鞍字亓前名称是肌球蛋白弗吉尼亚州。别名:羌∏虻鞍易逯蠱类中的一员,是依赖微丝无菌超净工作台宁波新芝生物科技公司肌球蛋白,重型多肽蛋白激酶,肌球蛋白琺旧宥ㄎ唬肌球蛋白是由于年在研究骨骼肌收缩时发现并命名的【浚它是一种马达蛋白,以肌动蛋白丝作为运行的轨道,通过乃獾贾鹿剐偷谋浠而在肌动蛋白丝上移动。肌球蛋白能够把馐头懦隼吹幕茏;4俳《蛋白移动的机械能,且它能催化猓杂直怀莆;祷福蚪蟹⒍鞍住大部分肌球蛋白在微丝上的移动方向都是从端移向耍珹是发动机蛋白运动的能源。肌球蛋白参与了包括肌肉收缩、趋化性、胞质分裂、胞饮作用、靶向小包运输及信号传导等在内的多种细胞活动,是生物体内很重要的一大类蛋白口】。肌球蛋白是一种超家族的蛋白质,到目前为止共分为类—随】览丛床煌挚梢苑治4的肌球蛋白和非传统的肌球蛋白硕⒉斡胂赴谖镏试耸涞摹蹦ν械鞍住А】话闳衔狹类蛋白在细胞内物质运输中发挥重要作用。魑P路⑾值某稍保O喙匮芯刻峁┝诵碌姆较颉近几年的研究发现赡苡胍恍┲琢龅姆⑸泄豼引。为进一步探索胫琢龅姆⑸欠窬哂邢喙匦裕颐橇⑾羁翁馐欠浅9婕∏虻白在肿瘤细胞转移中的作用及其调控分子机制。本研究构建匾煨云蔚脑表达质粒/泶锊⒋炕玫鞍祝:笮芯縈的作用提供研究工具。从而可以深入研究非常规肌球蛋白在肿瘤细胞转移中的作用及其调控分子机制。牧嫌敕椒标本0澹吮泶镌靥錚,大肠杆菌菌株与均由北京肿瘤医院临床实验室提供主要仪器趸己阄孪赴嘌上海跃进医疗器械厂撼上裣低,美国一贤饪杉止夤舛纫拦ǚ鬯橐
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盖形坏恪K母鲂∑戏直鹈猟、、K堑囊①连接好琼脂糖凝胶电泳装置,电泳槽中加入电泳缓冲液与适量储存液谘择合适制胶板,将其洗净、干燥,水平放置在工作台上,调整好梳子的高度。③称取凼墓直匿堂睦亟±堑塞生堂焦迨塞炊怂母左右的小片断。其中上游引物均含有盖形坏悖掠我锞含有序列见表.ü酆厦噶词椒从扩增∑体系:在冰上将的0澹的铮琹的,的酆厦酶的缓冲液,的钩逑导尤隤管中扩增:先℃预变性种印H缓姹湫耄嫱嘶耄延伸秒,此三步循环次。后N耾鉴定:通过琼脂糖凝胶电泳进行ā表镄蛄斜其中:为上游引物,为下游引物,//之间为酶切位点,//之前为保护碱基
胶板中。④凝胶凝固后,小心拔去梳子,将胶板放入电泳槽中萁的电