文档介绍：中国医科大学
硕士学位论文
pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建表达与口服减毒伤寒杆菌携带
Ag85A DNA疫苗免疫效应的研究
姓名:刘滢
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:吕昌龙
20090301
⋯本实验构建了⋯靥宓墓菇ū泶镉肟诜醵旧撕呙缑庖咝вΦ难芯菌携带实验材料一、主要仪器·中文论著摘要·刖目前全球约三分之一人口受到结核杆菌感染,每年死亡人数约蛉耍介苗魑D壳拔ㄒ涣俅彩褂玫囊呙纾湓し佬Ч⒉晃榷ā兄菩滦偷挠迄今为止对于结核杆菌的保护性抗原仍不十分明确,细胞外分泌性或细胞壁相关的蛋白被推测是保护性免疫应答识别的重要抗原。分泌型蝗衔?勺为结核病呙绲暮蜓∧康目乖1壤辈悸橙退沟卵芯克鵋究组多年来在对进行的研究中发现,携带基因的质粒呙缇肉注射给动物∈,主要引起兔庖哂Υ穑鶬、和‘,经基因枪注射则主要产生兔庖哂Υ鸷涂固宀皆黾印6诜醵旧趁氏菌携带呙缍孕∈竺庖咝вΦ挠跋炷壳吧形薇ǖ馈Mü蚬こ讨备的减毒沙门氏菌以其有效地递呈抗原、发挥免疫佐剂作用以及激发黏膜免疫等优势而被广泛用于呙缧滦拖妇靥宓难芯俊<醵旧趁攀暇诜揪睹疫小鼠,不仅安全、高效,而且可激发产生黏膜反应,对同源病原体和异源病原特异性抗体及用于单克隆抗体的制备。并用减毒沙门氏菌携带婧吮泶镌体经口服途径免疫小鼠,检测其免疫效应,为结核病诜呙绲牧俅灿τ媒~步提供理论和实验依据。流式细胞仪,二氧化碳孵箱,倒置显微镜,酶标仪,离心机,低温冰箱,超吾效疫苗防治结核病成为当务之急。体均表现出良好的保护力【】。靥宀⒈泶顰蛋白,用以检测
实验方法二、主要试剂三、实验动物一、一靥宓墓菇ㄓ氡泶⒅柿5奶崛∮爰编码基因的扩增⒅刈橹柿一墓菇⒆;爸刈橹柿<⒌鞍妆泶锛觳速离心机,超滤器,超净工作台等。培养基,,,,甈缬鞠喙厥约粒琁一丫、一约小鼠,周龄,叮鹤灾锌圃荷虾J笛槎镏行摹取出一。。∠柿#盖薪锖蚿靥澹用附辛印诱导蛋白表达,狿旱缬竞蚖检测蛋白表达情限制性内切酶,盒。崛≈柿#孟拗菩阅谇忻窧果经デ碇悄旱缬炯ā以畉—,虴盖屑ú⒉庑颉况。,珹琓
二、口服减毒伤寒杆菌携带呙缑庖咝вΦ难芯⒖诜呙绲闹票⑹笛槎锓肿榧懊庖小鼠,周龄,雌婊殖组:法检测血清中匾煨钥固宓味法检测脾细胞培养上清中购虸含量⑼,用于水浴消化质粒,经デ碇悄旱缬炯ā接种于含有卡那霉素的固体琼脂平板中,计数菌落数。并依据公式推算出所收获柿W椋虎诳质粒对照组;⑧正常对照组。分别将伤寒杆菌菌苗和生理盐水以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫三次,每次间隔三周。分别于初次免疫后弊低盐淮眼球采血分离血清,ḿ觳庑∈笱G逯蠥特异性抗体,酶标仪于Σ饬縊怠无菌取出感染小鼠脾脏,制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为痬收集上清,.保存,待购虸检测。,应用软件分析,绘制标准品标准曲线,计算实验数据经统计分析软件应用方差分析方法进行统计处理,酉妇刑崛≈柿#孟拗菩阅谇忻窧取收获的细菌进行倍的倍比稀释后,将,断∈偷木焊鱙玟细菌悬液中的细菌总数。死每组只小鼠进行相关检测。孔培养板上加入细胞悬液,軱,于。嘌。椅吕胄,细胞因子含量痬。有显著性差异。.
木讨论一靥宓墓菇蛋白的表达⒀G逯蠥特异性抗体滴度⒖诜庖吆蟛煌奔淦⑾赴锨逯蠭甆吖的分泌水平⒖诜庖吆蟛煌奔淦⑾赴锨逯蠭的分泌水平测序分析,,在分子量为τ蠥融合蛋白的表达,与预期的蛋白分子量一致。初次免疫后柿W樾∈罂笰抗体略有增高,滴度为第二次免疫后质粒组小鼠血清中的抗体水平迅速升高,而空质粒对照组小鼠血清中固迨贾瘴R跣浴柿W樾∈笃⑾赴嘌锨逯械腎—郊闯浓度达到/,与其它两组差异明显.?罩柿6哉兆楹驼6哉呙缈诜庖撸珹正常对照组三组小鼠脾细胞上清中一骄醇飨栽龀ぃ遗ǘ冉系停复合物是一类。拘蛋白质家族【,它是结核分枝杆菌和嘌滤液分泌蛋白的主要成分之一,其中分泌型鞍卓勺魑=岷瞬疫苗的候选目的抗原1臼笛橛眉醵旧趁攀暇;ば钥乖瑼真核表达载体经口服途径免疫小鼠,重点观察口服呙缇φ衬ど闳『笱G逯刑匾煨钥固澹脾细胞培养上清购虸的产生情况,结果提示小鼠血清中特异性抗体水平在里经双酶切证实成功构建了携带虻闹刈橹柿猯—相同。初次免疫后,∈驣组小鼠丫水平也有所增长,
綢在呙绮慕峁恢聀!肭鷈等证明,结论关键词初次免疫后即有升高,加强免疫后升高更明显,末次免疫后抗体滴度达到了,这说明口服减毒伤寒杆菌携带的呙缒苡行У赜盏夹∈笕硇蕴逡免疫应答。脾细胞培养上清痉置谒