文档介绍：中山大学
博士学位论文
华支睾吸虫SERPIN基因的克隆表达及其功能的初步研究
姓名:杨亚波
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:余新炳
20100528
华支睾吸虫基因的克隆表达及其功能的初步研究中文摘要专业:博士研究生:导师:病原生物学杨亚波余新炳教授华支睾吸虫病喑聘挝娌。怯苫Vж何腥疽鸬囊恢质吃葱匀耸薰不技纳娌 8貌≈饕A餍于中国、日本、韩国、越南及其它东南亚国家,全世界有将近蛉烁腥荆我国是最主要的流行区,感染人数约为颉A餍星木用裆郴蚴橙胛煮熟的含有华支睾吸虫活囊蚴的鱼、虾而感染,反复感染可使病情加重,导致胆囊炎、胆管炎、胆结石、肝纤维化甚至肝胆管癌。近年来,华支睾吸虫感染率呈现增高的趋势,⑾愀邸膄人体重要寄生虫病流行现状调查结果显示,全均达ィ餍星Vж何娓腥韭饰.%,与年的调查相比,感染率上升了%。其原因主要有:改变流行区居民的饮食习惯十分困难;追求新鲜、生食或半生食鱼虾等成为新的饮食时尚;华支睾吸虫华支睾吸虫基闪的克隆表达及其功能的移窖芯中笱Р┦垦宦畚,本课题由:夜匾J吃葱约纳娌〉姆⒉』萍胺乐窝芯计划项目钅勘嗪基金资助し栏挝娌∫嫔陀阌靡呙绲难兄易匀豢蒲Щ鹣钅鹱手阒莨茉蚕叱娌『突Vж何娌」丶乐渭际醯难芯”专题基金资助匾<纳娌〉募觳庥爰嗖夤抑卮罂萍甲ㄏ基金资助
白跣次P腟并对其免疫学特性及生物学活性进行评价;比较该基酶抑制剂基因渌跣次猳颍芯棵庖哐匦浴⑸镅Щ钚浴阶段性表达及组织定位,为研究囊蚴的成囊机制及研制鱼用疫苗奠定基础。渌跣次猳竦帽嗦胄蛄,表达重组蛋保虫宿主ā⑷⑹蠹捌渌吧的不可控性等。由于鱼是肝吸虫最重要的中间宿主,因此防止鱼感染肝吸虫将对阻断该病的传播起到事半功倍的作用。但目前关于尾蚴如何侵入鱼体或者在鱼体内形成囊壁的机制的研究尚未见报道。已有研究表明,丝氨酸蛋白酶在寄生原虫成囊过程中发挥着重要作用,其抑制剂可以显著降低成囊率,卡氏棘阿米巴的成囊和脱囊都与丝氨酸蛋白酶的作用密切相关。而丝氨酸蛋白酶作用的发挥必须受到其抑制剂的精确调控。事实上,许多研究已经表明寄生虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制宿主的丝氨酸蛋白酶,在抵抗宿主的免疫中发挥重要作用,如:马来布鲁线虫微丝蚴的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制人体中性粒细胞中的丝氨酸蛋白酶;曼氏血吸虫和埃及血吸虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂在维持自身的生理稳定及与宿主的相互作用中发挥双重作用。目前关于华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究,除了中有一条登录的序列外未见其它报道。那么,华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂是否也是成囊相关分子晌N颐瞧惹行枰=饩龅奈侍狻因此,本研究从华支睾吸虫囊蚴文库中识别华支睾吸虫丝氨酸蛋白芯磕康从华支睾吸虫囊蚴文库中识别华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因因在华支睾吸虫成虫和囊蚴阶段和蛋白水平上的表达差异以及在虫体的定位,为研究囊蚴的成囊机制及研制鱼用疫苗奠定基础。华支挈吸虫基蚓锌寺”泶锛捌涔δ艿某醪窖芯中山大学博士学位论文Ⅱ
进行椴ⅲ竦么笈蛄小Mü鼴榷曰竦帽嗦隒以比对后确定编码的文库质粒为模板,┰鑫鱏荩ㄏ芯糠椒基因的识别及全长序列的获得对本室构建的华支睾吸虫囊蚴全长质粒文库的表达序列标签测序后白的质粒文库的克隆号。┰觯抽提质粒庑虿⒔行蛄衅唇樱珺榷院笕范ㄈǔば蛄小J褂生物信息学技术对蛋白的分子量、稳定性、功能域及高级结构等进行预测。基因的克隆表达和重组蛋白的纯化根据目的基因的驮吮泶镏柿亩嗫寺∥坏闵杓埔铮克隆该序列到质粒,并对重组质粒进行⑺盖泻筒庑蚣ā将构建好的重组质粒转化甤疍⒂,用小鼠タ苟源炕闹刈榈鞍进行鉴定。纳镅匦院凸δ艹醪教教将纯化的庖叽笫蠡竦妹庖哐G澹琖观察免疫血清及感染华支睾吸虫的人和大鼠血清对相应的氖侗鹉芰Γ拿庖叻从π浴=玶行含明胶的狿笥靡鹊鞍酶水解,观察其对胰蛋白酶的作用;胍鹊鞍酌负湍因使卜跤察其对胰蛋白酶诱导的囊蚴脱囊的影响;同时通过观察重组蛋白对囊蚴脱囊的影响。在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的表达差异用法分别提取华支睾吸虫囊蚴和成虫的总孀B己蠡竦。以为内参,采用半定量法灰度扫描判断该基因囊蚴和成虫阶段华支睾吸虫基因的克隆表达及其功能的初步研究,大学博上学位论文Ⅱ
和均无信号肽,均有的功能域,但在功能域的反应位点环区域差异较大。蘅缒で琽锌缒で赡芪Dさ鞍住表达的高低,逗嫌ü夥ㄐ蠷范浇锥卧趍水平上的表达差异;以庖叽笫蠡竦玫难G逡约案腥净Vж何娴大鼠血清为一抗,鉴定蛋白在囊蚴和成虫阶段的表达。在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的免疫定位将华支睾吸虫囊蚴、成虫固定后石蜡包埋切片,免疫荧光法观察在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的组织定位。一抗用上述制备的初步纯化的抗拇笫笱G澹褂糜ü獗昙堑目勾笫髄抗体。荧光显微镜下观察并拍照。芯拷峁基因的全长序列和生物信息