文档介绍：重组质粒实验报告
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：
学****在实现DNA体外重组过程屮，正确选择合适的载体和限制性内切
酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学****设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。
学****利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源冃的DN***段连接起來，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
常握利用Cacl2感受态细胞的方法。
。
掌握a互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入
冃的DN***段的大小。学****和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：
外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA 分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、 ATP存在的连接缓冲系统屮，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起來。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在
选择性培养基中培养，可以通过a互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶
切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目
的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的冃的基因。其次耍选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法冇双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DN***段, 酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现冃的DN***段以相反方向插入载体分子屮，或冃的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件, 最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用吋应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
（耍达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量耍适当。另
外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%,就会抑制酶的活性。）
连接反应总是紧跟酶切反应，外源DN***段与载体分子连接的方法即
DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完
成的。DNA连接酶催化两双链DN***段相邻的5' ■磷酸和3' -OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最冇用的DNA连接酶是來自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1: (1^3)之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16°C, 用常用的连接时间为12-16ho感受态细胞的制备及质粒转化
构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DN***
段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素冇关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关,
常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和***化酶的突变株。目前常用的感受态细胞制备方法冇CaCI2法,制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油,-70°C 可保存半年至一年。经过CaCI2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源 DNA分子进入。在低温下，将携带冇外源DN***段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源 DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。 DH 5 a菌株为受体细胞，用CaCI2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19 质粒在42°C下热击90s,实现转化。
重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所冇的受体细胞都能被导入重组DNA
分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，