文档介绍：华中科技丈学网绮医学院博士学位论文
第一部分调控表达的锤头状核酶在肿瘤
免疫和移植免疫中的作用研究
中文摘要
移植后复发仍是对许多血液病人施行异基因骨髓移植的主要障碍之一。近年
来的临床移植实践证实供者淋巴细胞输注进行过继性免疫治疗在诱导
作用,巩固供者型嵌合体,治疗异体造血干细胞移植后复发,
以及移植后病毒感染等方面取得了可喜效果。更有研究表明,根治白
血病不仅是移植前预处理的结果,移植后供者淋巴细胞的起着根本性功效。
体内外实验证实供者淋巴细胞包括和细胞在后诱导的
效用中起重要作用,矿细胞在抗原提呈细胞的参与下,识别白血病
细胞编码的抗原而被活化,进而激活细胞使之成为效应性可
识别白血病细胞表面的‘类分子一白血病抗原随合物,被激活萨挥
作用。活化的细胞表面及表达均增高,而大量研究表明在体内
异常微环境及一系列细胞因子的作用下,白血病细胞表面可高表达,并可
通过途径诱导的细胞凋亡,降低其效应,从而逃逸免疫应
答,即所谓白血病细胞的“反击”作用。从提高诱导的效应的角
度出发,本课题构建了针对小鼠的锤头状核酶,将其导入小鼠细胞,观察
该核酶对细胞凋亡及增殖的影响,探索供者淋巴细胞输注时提高作用的
新途径。
切割小鼠锤头状核酶的构建
及其体内外切割活性的鉴定
旧的设计合成了针对小鼠的锤头状核酶基因,构建其细胞外转录
载体和真核表达载体,使其在聚合酶的作用下于细胞内高效转录。并
筛选出细胞外切割活性最佳的核酶,以高表达的小鼠淋巴瘤细胞株
本课题受国家自然科学基金资助
华中科技大常内挤医学院博士学位论立
作为模型,研究核酶修饰的基因对该细胞表达及增殖的影响,探索更
为有效的抗凋亡的新途径,并为后续的研究奠定基础。
方法设计并合成针对小鼠。和位点的锤头状核酶,同
时合成针对位点的突变型核酶作为对照,以排除反义序列互补
作用。应用分子克隆技术构建核酶的细胞外转录和真核表达载体,使核酶在
聚合酶启动子作用下高效转录。胞外转录出核酶和靶基因,进行细胞外
切割反应检测四种核酶对的切割作用,筛选出切割效率最佳的核酶。通过
电穿孔转染法将筛选出的核酶稳定导入细胞,测细胞内核酶的表
达,通过、免疫组化检测细胞上的表达,细胞经抗小鼠的抗体
作用后,通过法观察细胞的增殖情况。
「结果测序证实核酶基因被正确克隆入细胞外转录载体和真核载体
中。仅在细胞外具有切割靶基因的活性,切割效率达
与突变型核酶无明显切割作用。通过电穿孔转染法将成功
导入高表达的细胞,证实嵌于启动子中的核酶在细内
高效表达。和免疫组化结果提示在和蛋白水平的表窄显
下降,细胞经抗小鼠的抗体作用后,转染核酶的细胞增殖活性较对照组明显
增高,与之相反,转染突变型核酶的细胞无此结果。
结论本课题构建的嵌合型锤头状核酶在细胞内和细胞外均具能有
效切割,且转染至细胞后能高效表达,抑制细胞内基因和蛋白的表达,
增强了细胞的增殖活性,为研究抑制细胞的凋亡从而增强其效应提供实
验基础。
锤头状核酶抑制小鼠细胞凋亡
而增强其作用的实验研究
旧的研究针对位点的锤头状核酶对原代培养的小鼠脾脏细
胞和细胞系上表达及其介导的凋亡的抑制作用,探索供者淋
巴输注时增强细胞效应的新途径。
方法通过尼龙棉柱法分离小鼠脾脏细胞,与丁在条件下常规培
养。经流式细胞仪测得其和的表达。通过电穿孔转染法将
华中科波大学同济医学陀博士学位伦之
与导入细胞,通过和分别检测细胞上
和蛋白水平的表达细胞与高表达的小鼠细胞白血病细胞株
混合培养后,通过活性检测试剂盒测各组细胞活性的变化,
法测各组细胞的增殖情况,凋亡检测试剂盒测细胞凋亡,以乳
酸脱氢酶释放试验检测的体外杀伤活性。
结果尼龙棉柱法成功分离了小鼠脾脏细胞阳性率大于,经
活化后高表达。电穿孔转染法能将核酶成功地导入小鼠细胞,与对照组、
空载体转染组相比,细胞表面的表达明显降低与孵育后,与空白对照、
转染空载体的细胞相比,转染核酶的细胞增殖活性明显增加,而细胞的
活性降低,且细胞的凋亡率显著降低,且细胞的体外杀伤活性亦显著增强。
结论小鼠活化细胞和细胞因子处理的上表达,抗核酶能显
著降低其水平,使细胞免于途径的凋亡,增加细胞的存活率和体外杀伤
活性,为临床上增强时的效用提供实验依据。
抗核酶在移植免疫中的作用研究
目的以适当的方法分离组成性或诱导性表达的小鼠肝脏细胞,胰岛细胞及
新生小鼠皮肤成纤维细胞,将抗基因位点的锤头状核酶导入以上细胞,
研究核酶对上述细胞表达及介导的凋亡的影响,探索提高移植物存活率
的新途径。
方法分别采用胶原酶两步灌流法和型胶原酶分离小鼠肝脏细胞和胰岛细
胞,以工型胶原