文档介绍：四川大学博士学位论文
枯草芽抱杆菌植酸酶加‘基因的克隆及其表达研究
遗传学专业
博士研究生吴琦指导教师刘世贵教授王红宁教授
植酸酶作为一种绿色添加剂,已日益广泛使用于饲料工业中。研究表明,
来源于芽抱杆菌的植酸酶属于中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性,有助于抵
抗饲料制粒或者膨化过程中引起的酶失活,而且其酶促反应的有效作用范
围在之间,适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类,以及在单胃动物中
值呈中性的肠道段中表现酶活力。目前,国内外尚无商品化的中性植酸酶投入
市场。
本研究从己筛选获得的中性植酸酶产酶菌株枯草芽抱杆菌
出发,根据上的芽抱杆菌基因序列设计了
一对引物,采用法获得芽抱杆菌植酸酶的全长基因,并将其克隆到
一载体。序列分析表明,该基因全长,编码一个氨基酸的多
肤。通过与中登录的其他个植酸酶基因的核酸序列和氨基酸序列进
行比较,建立了系统进化树,结果表明所有芽抱杆菌植酸酶具有较高的同源
性,来源于株芽抱杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。利用在线生物信息学
数据库及生物软件对本基因进行了信号肚序列、糖基化位点、密码子偏爱性
等分析,并对其二级结构、疏水区和三维结构进行了预测。
植酸酶基因序列及其氨基酸序列在中登录,登录号分别为
和
根据芽抱杆菌植酸酶基因序列及大肠杆菌表达载体丁一多克
隆位点序列,采用法获得不含有信号肤序列的植酸酶基因的非融合和
融合表达片段。经克隆及序列测定后,构建了带有启动子的大肠杆菌的
植酸酶和表达载体,并转入大肠杆菌,实
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现了有生物学活性的表达。研究了诱导温度、诱导浓度和乳糖诱导浓度对
植酸酶非融合和融合表达的影响,并对表达目的蛋白的可溶性进行了分析。结
果表明,非融合表达在℃和℃表达产物以包含体形式存在,无表观酶活,
而℃诱导的表观酶活最高融合表达载体在℃表观酶活较低,而℃诱
导的表观酶活最高。表明降低诱导温度有助于实现目的蛋白的可溶性表达。两
种表达方式的工最适诱导浓度为,乳糖最适诱导浓度为,但
乳糖诱导表达的时间推迟,且表达量不及的诱导。分析表
明,非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的和,分子量
分别为和
为实现芽抱杆菌植酸酶‘基因的分泌表达,以及由酵母翻译后加工可能
带来的酶学性质改善,首次进行了该基因在酵母中的表达研究。根据芽抱杆菌
植酸酶基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体和工多克隆位
点序列,采用法获得不含有信号肤序列的植酸酶‘基因胞内表达和分泌
表达片段。经克隆及序列测定后,构建了重组表达载体和
,经线性化后,电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌。经
和平板筛选、检测和酶活性测定,获得阳性重组酵母,首次在毕
赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽抱杆菌植酸酶的胞内表达和分泌表达。
分析表明,胞内植酸酶表达量约占菌体总可溶性蛋白的,分子
量为而分泌表达的植酸酶为和两种分子量的蛋白,
去糖基化试验证明这是由于产物糖基化程度不同引起的糖蛋白。用麦芽汁半合
成培养基对分泌表达重组酵母进行培养,经诱导酶活可达到,表
达量为出发菌株的倍。
将本研究获得的芽抱杆菌植酸酶的种基因工程菌表达产物,即大肠杆菌
表达的非融合植酸酶和融合植酸酶、酵母胞内表达的植酸酶和分泌表达的植酸
酶,通过初步纯化后,对其最适反应温度、热稳定性和最适反应值进行了测
定。结果表明,种基因工程植酸酶的最适反应温度分别为
和,与天然植酸酶相比,分别降低了℃和增加了℃和。热
稳定性测定表明,经℃处理时,种基因工程植酸酶分别表现为酶活急剧下
降,几乎没有损失,损失较小和几乎没有损失在℃水浴和后
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的残留酶活性分别为和和和
以及和,均比天然植酸酶的有所提高种基因工程植酸酶的最
适反应分别为和催化效率在以上的有效反应范
围分别为和,比天然植酸酶的扩大了
个
关键词枯草芽抱杆菌,植酸酶,基因,大肠杆菌,毕赤巴斯德酵母,
表达
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磷是动物必需的一种常量矿物元素,磷的添加对配合饲料生产成本及产品
质量有重要影响。作为猪、禽饲料主要来源的玉米、豆饼粕、谷糠、棉籽饼粕
等,它们所含的磷约以植酸磷的形式存在。而猪、禽等单胃动物,由于
消化道内缺乏能分解消化植酸磷的微生物,仅能利用玉米中磷的、豆饼
中磷的,典型猪日粮中磷的利用率只有,其余左右的磷从粪