文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
用于防龋DNA疫苗粘膜传递的有效载体的研究
姓名:高莉
申请学位级别:硕士
专业:生物制药工程
指导教师:刘卫
2011-01-20
华中科技大学硕士学位论文
摘要
核酸疫苗等基因药物为亲水性的大分子,容易被降解,不宜直接作为药物使用,
因此需要借助合适的载体传递。近年来纳米技术在药物传递中备受研究者的青睐,
在基因治疗中也被广泛应用。纳米传递系统中研究较为成熟的是阳离子脂质体。在
本论文中,我们首先制备了 DOTAP/DOPE 脂质体;其次加入一种油相发展成阳离子
脂质乳剂,将这两种阳离子脂质载体与 DNA 孵育得到相应的复合物;最后引入鱼精
蛋白,又得到阳离子脂质载体/鱼精蛋白/DNA 的三元复合物。主要工作如下:
(1)采用薄膜超声法制备阳离子脂质体,采用探头超声法制备阳离子脂质乳剂,
对空白脂质体和脂质乳剂的粒径、zeta 电位、形貌和稳定性进行考察。结果表明制备
工艺有较好的重复性,空白载体稳定性较好。
(2)制备了阳离子脂质体/DNA 复合物、阳离子脂质乳剂/DNA 复合物、阳离子脂
质体/鱼精蛋白/DNA 复合物、阳离子脂质乳剂/鱼精蛋白/DNA 复合物。表征结果显
示 N/P 在 2 以上时,DNA 与阳离子脂质载体形成稳定且带正电的复合物;核酸酶切
保护实验结果表明复合物能较好地保护 DNA 抵御核酸酶的降解。我们还对高浓度复
合物的制备方法进行了研究。
(3)我们将 4 种复合物分别对 CHO-K1 细胞进行转染和 MTT 细胞毒性评价,结
果表明复合物的细胞毒性较小,转染的最佳 N/P 比为 2,阳离子脂质体的转染率要远
高于阳离子脂质乳剂,鱼精蛋白能适当提高转染率,血清对两种载体系统均有负面
影响。
(4)在 Balb/c 小鼠上进行防龋 DNA 疫苗的免疫应答评价。结果显示加入鱼精蛋
白后抗体表达水平提高约 3-4 倍,与体外实验相比乳剂与脂质体组的表达差距明显减
小。
综上所述,DOTAP/DOPE 阳离子脂质体、阳离子脂质乳剂与 DNA 通过静电作
用自组装形成复合物,分别加入鱼精蛋白后得到三元复合物,这 4 种复合物均能介
导基因的体外转染和体内表达。结果显示乳剂在体内应用时具备一定潜质,而且鱼
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精蛋白对体外转染率和体内表达均有增效作用,值得进一步研究考察。

关键词: 非病毒载体;阳离子脂质体;阳离子脂质乳剂;鱼精蛋白;
防龋 DNA 疫苗
II
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Abstract
A major challenge for clinical application of ic medicines is to develop suitable
carriers to e their hydrophilicity, likely to be degradated. Nanotechnology
promises great versatility in the field of drug delivery, especially in DNA ine.
Liposome is the most extensively described and studied nanoparticles. In this study,
DOTAP/DOPE liposome was firstly prepared, then developed to cationic lipid emulsion
after adding an oil phase. plexes were made by incubating with DNA respectively.
Finally, plexes were obtained by introducing a polycationic peptide namely
protamine sulfate. The whole study was as follows:
(1) DOTAP/DOPE cationic liposomes were prepared by the method of film
dispersion, DOTAP/DOPE/Tween 80/Squalene cationic lipid emulsions were obtained by
sonication. We investigated the size and zeta potential, morphology and physical stabil