文档介绍：紫外法测定蛋白质含量( 3学时)
1目的
学****紫外法测定蛋白质含量的原理和方法,熟悉紫外分光光度计的原理和使用方法。
2原理
蛋白质对280nm的紫外光有最大吸收,这是因为含有Tyr和Trp的缘故,蛋白质溶液的280nm的吸光值与其浓度成正比,可作定量测定。
3器材
7500紫外分光光度计,石英比色皿,擦镜纸,试管,移液管,洗耳球
4试剂
(1)1mg/ml 血清蛋白标准液
(2)未知浓度蛋白质溶液
5操作步骤
(1)标准曲线的绘制:取五支试管,按下表编号并加入试剂:
试剂
管号
1
2
3
4 5
1mg/ml标准蛋白溶液(ml)
0
蒸馏水(ml)
0
蛋白质浓度(mg/ml)
0
OD280
加毕,混匀,用紫外分光光度计测OD280,以光密度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标作图,回归出线性方程,显示R2。
(2),,混匀,测OD280,利用回归方程计算蛋白质浓度。
6注意事项
(1)标准曲线制作时准确配制蛋白质的梯度浓度。
(2)使用的比色皿要比较其空白吸光值的差异,如差异过大(>),则测样品时注意加减差值;
(3)熟练掌握紫外分光光度计的使用。
附:7500紫外/可见分光光度计的使用
一、原理
工作的依据是比尔——郎伯定律:
A=KLC
式中A为被测物质对单色光的吸光度值,K为被测物质的吸收系数,与入射光波长及被测物质的特性有关,L为被测物质的厚度,与比色皿的厚度有关,C为被测物质的浓度。
二、操作步骤
1. 开机。打开7500主机电源,仪器显示板LCD上显示“UV/VIS 7500”。随后钨灯自动点亮,氘灯在钨灯点亮后约6 sec左右自动点亮。打开主机电源后,主机自动作一系列自检工作:
波长复位
搜索氘灯特征谱线
搜索完毕
自检结束
步骤
7500主机自检工作
LCD显示
注释
1
将四联吸收池架内所有比色皿取出,确保光路中为空
2
最高波长自动回复中
P
UV/VIS 7500
3
波长自动回位
字符消失
4
自动搜索氘灯特征谱线
SELF – CALIBRATION
WL***.*
***.*为波长数据
5
特征谱线搜索完毕
SELF-CALIBRATION
**
**代表氘灯能量
6
当未搜索到氘灯特征谱线
NO FOUND D2 LAMP
CHARATER
7
自检结束
SELECT MODE
SING SCAN TIME
预热20min可进行操作
此时仪器自检结束,预热20 min后,可以进行样品测量。