文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
MCMV感染对神经干细胞Wnt信号通路上游分化相关靶基因蛋白
Wnt-3和Wnt-7a表达的影响
姓名:张慧娟
申请学位级别:硕士
专业:儿科学
指导教师:方峰
2010-05
华中科技大学硕士学位论文

MCMV 感染对神经干细胞 Wnt 信号通路上游分化相关靶基因蛋白
Wnt-3 和 Wnt-7a 表达的影响
研究生张慧娟
导师方峰教授
中文摘要
【目的】
研究鼠巨细胞病毒(MCMV)对神经干细胞 Wnt 信号通路上游分化相关靶基因
Wnt-3 和 Wnt-7a 蛋白表达的影响,以进一步探讨 CMV 致胎脑发育异常的分子机制。
【方法】
⑴分离培养小鼠神经干细胞(NSCs):剖宫取出孕的 BALB/c 胎鼠,去除脑
膜,取脑组织,用 PBS 冲洗,过滤制备单细胞悬液,用含 EGF (20ng/mL)、bFGF
(20ng/mL)和 B27(2%)的 DMEM/F12 培养基培养。第 3 代小鼠神经干细胞用
于后续实验;
⑵建立 MCMV 感染 NSCs 分化培养细胞模型:用高、中、低三种感染复数(MOI
分别为 5、1 和 )的 MCMV 毒株感染 NSCs,用含 2%胎牛血清(无 EGF、bFGF
和 B27)的 DMEM/F12 培养基培养诱导其分化。同期设正常 NSCs 分化培养作为
对照;
⑶ MCMV 感染对神经干细胞 Wnt 信号通路上游分化相关靶基因蛋白 Wnt-3 和 Wnt-7a
表达的影响:用 Western blot 法检测分化培养后、1d、2d、3d、4d 和 5d NSCs
Wnt 信号通路上游蛋白 Wnt-3、Wnt-7a 表达水平的动态变化。实验重复三次。
【结果】
⑴小鼠神经干细胞体外分离和培养成功,可连续传代,保持球形生长的能力;采用
含 2%胎牛血清(无 EGF、bFGF 和 B27)的 DMEM/F12 培养基培养可进一步诱导
其分化;
⑵当 MCMV 感染 NSCs 后,镜下可见细胞贴壁受影响,已贴壁的神经球出现肿胀飘
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起,神经球边缘的细胞发生脱落,部分细胞崩解坏死。细胞形态改变随病毒感染
复数(MOI)的增加而更加明显;
⑶ Western blot 法检测结果:
a) 正常对照组 Wnt-3 蛋白表达呈双峰型,在分化 2d 和 5d 时达峰值,第二峰值高
于第一峰值。各感染亚组 Wnt-3 蛋白表达亦于分化 2d 达峰值;MOI= 亚组在分
化 5d 出现第二峰,但峰值显著低于第一峰,而 MOI=1 和 5 亚组在分化 2d 后表达
水平逐渐下降,第二峰缺失;除 MOI= 亚组分化 2d 以外,其余各感染亚组与各
时间点 Wnt-3 蛋白表达量均显著低于正常对照组(P<);MOI=1 亚组分化培
养和 2d 与 MOI=5 亚组分化培养 1d、2d 和 5d 表达量均明显低于 MOI= 亚
组(P<);
b) 正常NSCs分化培养后Wnt-7a蛋白表达先增后降,在分化1d达峰值。MOI=
组Wnt-7a蛋白表达的时序性变化与正常对照组相似。而MOI=1和5亚组Wnt-7a蛋白
=(P<),峰值后移
至分化培养3d,MOI=1亚组峰值显著低于正常对照组(P<)。
【结论】
⑴ MCMV 抑制分化培养 NSCs 细胞的 Wnt-3 蛋白表达,其抑制程度随感染滴度增加
和分化进程而趋于明显;MCMV 在分化早期(~1d)抑制 Wnt-7a 蛋白表达,
使其峰值后移,其抑制效应随感染滴度增加更趋明显;
⑵ MCMV 抑制 NSCs Wnt 信号通路上游分化相关靶基因 Wnt-3 和 Wnt-7a 蛋白表达可
能是其干扰 NSCs 增殖分化导致胎脑损伤的重要机制之一。

关键词:巨细胞病毒;神经干细胞;Wnt 信号通路;Wnt-3;Wnt-7a

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The influence of MCMV infection on the protein expression of
Wnt-3 and Wnt-7a, the upstream-differentiation-related target
genes of Wnt signaling pathway in neural s