文档介绍：(一)基本概念: ?克隆( Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。?分子克隆( Molecular Cloning) 是在体外对 DNA 分子按照既定的目的和方案进行人工重组,将重组分子导入到合适的受体细胞中,使其在细胞中扩增和繁殖, 以获得 DNA 分子大量复制,并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。载体 DNA ( vector ) 目的 DNA ( target fragment ) 重组 DNA ( binant DNA ) 宿主( host ) 筛选、扩增克隆( clone ) 分子克隆的路线分子克隆的路线 DNA 重组转化分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接筛—重组 DNA 的筛选与鉴定转—重组 DNA 导入宿主细胞 Con ten ts Con ten ts 聚合酶链反应制备基因组 DNA制备 cDNA 人工合成基因. 目的基因来源粘性末端连接平头末端连接人工接头法同源多聚尾连接法将目的基因和载体用同一种限制酶酶切, 产生相同粘性末端,再通过 DNA 连接酶作用将两者连接起来,构成重组DNA 分子有些限制酶只能将目的基因和载体 DNA 切割成平端,此时在 T 4 DNA 连接酶的作用下同样能连起来。合成连接子→与 DNA 平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接,构建重组DNA 。要求 DNA 分子内部必须完整, 即两个 DNA 链间不存在缺口; 否则末端脱氧核苷酸转移酶也会在 3’-OH 上加入多聚尾巴,破坏了 DNA 分子活性?转化: 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程?转染: 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程?转导: 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程类型类型平板筛选(插入失活、蓝白筛选) 限制酶切图谱筛选 PCR 筛选重组体原位杂交技术 4 123 重组 DNA 的筛选与鉴定方法 : (1). 使核酸降解的核酸酶类: 核酸内切酶、核酸外切酶。(2).催化核酸合成的酶类: DNA 聚合酶, RNA 聚合酶,连接酶,逆转录酶。(3). 核酸修饰酶类; 甲基化酶,激酶,基团转移酶, 磷酸酶等。