文档介绍：第三章细胞工程制药
教学目的
掌握细胞融合方法;
掌握杂交瘤技术;
了解生物转化法及其应用。
教学重点:细胞融合、杂交瘤技术
教学难点:杂交瘤技术基本原理
计划学时:4
第一节概述
细胞工程的主要技术及其应用
细胞工程
细胞与组织培养技术
作物改良、花卉林木繁殖、产前诊断、遗传病防止
细胞大批培养技术
名贵药物、其他生物药品
细胞融合技术
创造新植物、生产单克隆抗体、培育高产新菌种
染色体工程技术
创造作物新类型
细胞器移植技术
创造动植物新品种
体外受精和胚胎移植技术
动植物改良、人类优生
DNA重组技术
动植物改良、基因治疗
外源基因导入技术
物理化学技术
第二节细胞融合
一细胞融合技术的发展
1 细胞融合定义
细胞融合是指人为地使两种不同的生物细胞在同一培养器中,用无性的人工方法进行直接接触,产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。
2 细胞融合技术发展简史
(1)动物细胞
1838年M iller 最早描述了脊椎动物肿瘤细胞可融合成多核细胞的现象
1875年Lange 观察到蛙的血细胞中也存在多核细胞的现象
1907年Harrison 体外组织培养技术建立及其以后的发展,发现了体外培养的细胞也能融合成多核巨细胞,为细胞融合的研究工作创造了实验条件
50年代初发现麻疹病毒和腮腺炎病毒能引起细胞融合
1954年 Stahelin 用连续照相的方法追踪了炭疽杆菌的原生质体融合
1958年冈田善雄用高浓度仙台病毒在体外使小鼠艾氏腹水瘤细胞得以融合,他的这一发现打破了细胞融合只能在同种生物间进行的枷锁,为生物的远缘杂交育种奠定了基础
1965年Harris用仙台病毒在体外使培养的Hela细胞与小鼠艾氏腹水瘤细胞融合成杂种细胞
1975年Milstein和kohlor两人首先将骨髓细胞和脾细胞进行融合,获得了产生抗体的杂交瘤细胞,这种杂交瘤细胞继承了来自两个亲本细胞的特性,既能分泌抗体又能像肿瘤细胞那样快速无限的生长繁殖,因而
创建了杂交瘤技术。
(2)植物细胞
1970年 Cocking找到了合适的酶破坏植物细胞,使其形成原生质体
1972年卡尔逊用硝酸钠作融合促进剂,把不同的烟草原生质体进行融合,获得体细胞杂种
1978年,德国科学家首次把马铃薯和番茄的原生质体进行融合,获得体细胞杂种
(3)微生物细胞
1953年Weibull等首先用溶菌酶溶解细菌细胞壁获得原生质体
1958年Brenner等提出细菌原生质体的标准
Eddy等用蜗牛酶并配合其他条件,分别从酵母菌及丝状真菌中制备出原生质体
Dougals首先用溶菌酶从链霉菌菌丝中制备出原生质体,并用噬菌体吸附及血清学试验证明细胞壁确实已经被溶解;
冈西等对链霉菌原生质体形成和再生条件进行了系统研究
Landman等对枯草芽孢杆菌原生质体形成和再生进行广泛研究
1974年聚乙二醇(PEG)诱导融合方法建立,目前PEG基本代替了仙台病毒作为细胞融合的促融剂。
二细胞工程中遗传物质的转移途径
(一)遗传物质转移技术是指转移核或含有DNA的细胞器的技术。
1 遗传物质的转移方式
(1)完整细胞之间的融合作用
—般取对数生长期细胞为融合材料。两种完整细胞融合也基本适用于原生质体融合。这种融合方式所转移的遗传物质比较广泛,它既包括整套染色体组,又包括核外DNA及细胞质因子等。两种完整细胞的融合是扩大生物体变异的有效手段。
(2)核体与完整细胞或胞质体的融合作用
动物细胞在含细胞松弛素B或简称为松胞素B(CB)的培养液中培养后,在离心力的作用下细胞核能从细胞质中分离出来,使细胞形成核体与胞质体两部分。通常将细胞核连同其外面薄层细胞质构成的颗粒称为核体,而不具有细胞核而仅有细胞质的细胞称为胞质体。
松胞素B的作用主要是破坏细胞的微丝,只要掌握松胞素B的浓度、作用时间及离心条件,就能制备出理想的核体和胞质体。用细胞融合的方法,将核体与完整细胞或核体与胞质体融合构成杂种细胞,后者是典型的重组细胞。
(3)胞质体与完整细胞的融合作用
胞质体与完整细胞融合形成的胞质杂种细胞,主要是胞质体内的线粒体、叶绿体以及mRNA等改变了完整细胞的遗传性,主要传递耐药性及雄性不育等遗传性状。
(4)脂质体介导的细胞融合
A 什么是脂质体介导的融合作用?
将重组DNA分子包埋于脂质体微囊内,通过脂质体微囊与宿主细胞融合作用,将外源性目的基因转移至宿主体内的过程,称为脂质体介导的融合作用。
B 脂质体的制备过程
在含重组DNA分子的水溶液中加入磷脂及及吐温80等乳化剂通过激烈搅拌或超声波处理,将磷脂分散于水溶液中。静置后,磷脂分子则群集成液晶态脂质双层薄膜