文档介绍：第九章 DNA序列测定
第一节概述
一、DNA序列测定
即核酸DNA分子一级结构的测定,是现代分子生物学一项重要的技术。

1963年,Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定,这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期,Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法,Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段,使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易,这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。
二、DNA序列测定工作原理
在四种反应体系中,寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基,将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断,并使其一端为一固定的末端,而另一端由于长度不同,成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离,放射自显影,可直接读出DNA的序列。
三、核酸序列分析的目的意义和策略(具体方法)
(一)序列分析的目的,2种:
1、确证性测序通过测定对突变进行定位和鉴定,应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。(已知基因序列)
2、从头序列目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。(未知基因序列)
(二)测定在生物医学领域相应应用,2个方面:
1、对已知基因序列检查,特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变,有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。
2、对已经克隆的未知序列进行测定,从而阐明该基因的一级结构,如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。
(三)序列分析的策略(具体方案)
测序目的不同或靶DNA片段大小有区别,则序列分析的具体方案有所不同,所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略,这个问题在后面将涉及到,但由于学时限制,不可能完全展开来讲,请同学参看相关书籍。
四、测序的常用方法
DNA序列测定常用方法有如下3种:
1、末端终止法
2、化学裂解法
3、DNA测序自动化
使用特异性引物与单链模板DNA退火,在DNA聚合酶作用下进行延伸反应,用ddNTP终止,用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA,从而完成测序的方法。
用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段,产生一簇各种长度的短链,经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。
类似末端终止法,所不同的是用荧光染料标记,计算机自动读出。
优点
简便、迅速、应用广泛。
不需酶促反应,可以对寡核苷酸测序。
1、高负荷,1块胶可测16个样品;2、机读不需放射自显影;3、安全不用同位素;4、简单迅速8-10h。
不管是上述哪一种方法,测序基本过程如下:
1、制备待测DNA序列模板;
2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”(n=1);
3、PAGE;
4、读序。(P255,图10-2)
五、测序的基本过程
六、测序技术的最近发展
1、商品化测序试剂盒解决了质粒问题,节省了时间,但缺乏灵活性。
2、自动化测序仪以酶学测序反应或(和)放标测序产物为基础,微机处理。
3、热循环测序使极少数测序产物线性放大。
4、测序商品化 60.-180.￥,搞定。
七、DNA序列测定的应用
分析基因组核苷酸排列序列
分析基因序列
基因定点诱变的基础
基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础
确定DNA序列中蛋白质的编码区
第二节 Sanger双脱氧末端终止法
一、原理
(一)DNA复制的4个基本条件
1、ssDNA模板
2、DDDP
3、带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物
4、4种dNTP
(二)链终止剂(chain-reminator)----2,3-二脱氧核糖核酸酶
当3’-OH由于脱氧或被取代,下一个核苷酸不能通过5’磷酸形成3’,5’磷酸二酯键,使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相同的4组引物-模板混合物,每一组加4种dNTP,其中1种用32P(或35S)标记,加1种ddNTP,每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端的不同长度的核苷酸链,经PAGE分离,即可读出被测定的全部顺序(dNTP和ddNTP竞争结合底物)。(P255,图10-2)
(三) Sanger双脱氧链终止法的原理
在DNA合成时,利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中,分别加入不同的ddNTP,其他试剂相同,经酶促合成反应,生成具有相同的5′末端,而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离,放射自显影,直接读出DNA的核苷酸序列。