文档介绍：CONTENTS
基因敲除技术原理简介
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基因敲除小鼠的基因型鉴定
2
基因敲除小鼠的饲养和繁殖
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基因敲除技术原理简介
一、
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基因敲除小鼠技术 (knock-out mouse technology )是指
通过基因工程的方法使小鼠体内某种基因功能缺失的生物
学技术。
传统的基因敲除方法有：
①插入突变法
②同源重组法
③RNA干扰(RNA interference,RNAi)法
目前在同源重组法的基础上改良的基因敲除技术有：
①借助Cre-loxp系统的条件型基因敲除法
②CRISPR／Cas9 技术
（棕褐色AA）
（白色）
（Aa）
（Aa）
(AA)
(AA)
（Aa）
（Aa）
(aa)
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胚胎干细胞的分离培养
首先将129小鼠胚胎分离培养，待胚胎周围逐渐形成ES细胞集落。
然后将ES细胞集落从培养的胚胎周围分离。进行一段时间的培养后将ES细胞集落吸出分散成单个的细胞，将这些单细胞分离出来进行常规培养。
最后对分离培养的ES细胞进行鉴定。（它应该具有正常的二倍体核型及体内外分化能力）
鉴定方法
①把这种胚胎移植到雌性假孕鼠的子宫内，是否形成“ 嵌合体 ”胚胎 。
②将ES细胞注入到同种或免疫缺陷性小鼠的皮下、睾丸或肾包囊，观察注入的细
胞在宿主动物体内是否形成畸胎瘤。
③把受试细胞在体外进行随机自发的分化或诱导它们向不同胚层的细胞分化。一般
的方法是去除饲养层细胞后，ES细胞聚集并形成类胚体 。
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构建基因打靶载体
根据需敲除的基因序列的特点设计的含有2个标记筛选基因和特定基因同源臂序列的靶向载体。以敲除小鼠Fam172a基因为例：
靶向载体
Fam172a
同源序列
靶基因
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同源重组
将打靶载体导入129小鼠ES细胞：目前常用的方法有显微注射法和电穿孔法。
同源重组筛选：由于哺乳动物细胞中基因随机整合的机率要远大于同源重组，因此需要利用选择性标记基因将发生同源重 组的细胞筛选出来， 目前常用的筛选方法有正负双向选择法。
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正负双向选择法
neo:正向选择基因。具有新霉
素(G418)抗性，其在发生随机
组合和同源重组的细胞中都可
以表达。
HSV-tk：负向选择基因。在发
生同源重组时别剪切掉，发生
随机组合时被保留。tk基因可
使无毒的丙氧鸟苷（GANC）
转化为毒性核苷酸而杀死细胞。
neo基因保留，tk基因被切除
对G418和GANC都有抗性
对G418有抗性，对GANC敏感
neo、tk基因均被保留
靶向载体
筛选出中靶ES
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基因敲除小鼠的产生
将中靶的ES细胞注入到BALB/c小鼠囊胚，接种到新的培养皿中进行培养。
将正常发育含ES细胞的囊胚移植入受体小鼠子宫内
嵌合体小鼠的鉴别：通过观察小鼠被毛的颜色就可确定嵌合体小鼠。
基因敲除小鼠的制备：因为在同源重组过程中，ES细胞的2条染色体中一般只有1条进行重组，得到嵌合 体小鼠后，还要经过至少2代的繁育过程才能得到基因敲除小鼠。
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基因敲除小鼠的基因型鉴定
二、
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提取小鼠尾部DNA组织
PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型
针对不同的Fam172a+/-，Fam172a-/-，WT设计不同的引物
采用PCR仪进行扩增：变性→退火→延伸
取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳
根据凝胶成像仪中的条带鉴别基因型
可能的结果分析
Fam172a+/-出现两条带，Fam172a-/-只出现一条带，WT出现一条带，但Fam172a-/-和WT出现的位置不 同。
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