文档介绍：第三章细胞生物学研究方法
(研究方法和工具)
教学目的
1 了解主要工具和常用方法,侧重掌握基本原理和基本应用;
2 认识工具和方法与学科发展的相关性。
教学重点仪器方法的基本原理和基本应用
教学难点电镜制样及分子杂交技术
教学方法讲授、参观
第一节细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜技术
(一) 普通复式光学显微镜技术
(二)荧光显微镜(fluorescence microscope)
(三)暗视野显微镜(darkfield microscope)
(四)相差显微镜(phase contrast microscope)
(五)激光共焦点扫描显微镜(略)
(六)微分干涉显微镜(略)
二、电子显微镜技术
(一)电镜设计原理及分类
(二)电镜的种类
(三)透射式电子显微镜
(四)光镜与电镜的主要区别
综上可见,电镜与光镜区别主要在于:
(1) 光源不同光镜为可见光或紫外线;电镜为电子束
(2) 透镜不同光镜为玻璃;电镜为电磁透镜
(3) 真空
(4)显示记录系统
(五)扫描式电子显微镜
扫描电镜的特点
扫描电镜的基本结构
(六)电镜样品制备技术
1 超薄切片技术(详见光盘)
2 负染色(negative staining)技术
3 核酸大分子的制样技术(大分子铺展技术,Kleinschmidt法)
4 整装细胞电镜技术
5 电子显微镜细胞化学技术
是能过特殊的细胞化学反应,使待测物转变成某种不溶性的电子致密沉淀物,并利用电镜在超微结构水平上对产物进行定位和半定量。主要有各种酶的定位,其次是核酸、蛋白质、脂肪、碳水化合物等的定位。
酶的化学定位技术
免疫细胞化学电镜技术(见本编第十一章)。
6 冰冻蚀刻技术(freeze etching)
7 扫描式电镜制样技术
第二节细胞组分的分析方法
(生化分析法)
一、超速离心技术分离细胞(组分)及生物大分子
(一) 各种离心技术——分离细胞器、生物大分子
离心方法:根据分离对象和目的不同,采用不同的离心方法,制备离心和分析离心。
(1)制备离心(preparative centrifuge) 分离和纯化亚细胞成分和大分子,目的是制备样品。
差速离心法:是最常用的方法,根据不同离心速度所产生的不同离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。
密度梯度离心(区带离心法)
a、速率区带离心法(蔗糖密度梯度离心)
b、等密度梯度离心法(氯化铯密度梯度离心)
(2)分析离心(analytical centrifuge) 分析和测定制剂中纯的大分子的种类和性质,如浮力密度和分子量、生物大分子的构象变化、分析样品的纯度等。此工作必须是在制备离心的基础上进行。
(二)细胞的选择性抽提(分离蛋白质、核酸大分子)
(三)柱层析的技术(分析蛋白质和核酸)
(四)电泳技术
(五)色谱分析技术(色谱学——分离纯化样品)
(六)氨基酸分析技术
二、细胞化学技术
(一)组织化学和细胞化学法
基本原理:利用某些化学物质和某些细胞成分发生化学结合,从而显示出一定的颜色,进行定性和定位研究的方法。
(二)免疫细胞化学法(特异蛋白抗原的定位与定性)
基本原理:此项技术是将免疫学中抗原、抗体以及补体间专一性反应结合显微或亚显微组织学的