文档介绍：微生物实验技术
第二章
微生物的纯种分离及培养技术
微生物的纯种分离及培养技术
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
实验2-2 化能自养微生物的分离与纯化
实验2-3 从沼液中分离产甲烷细菌
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
一、实验目的
1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学板倾注法和斜面接种技术,了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学板菌落计数法。
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
二、实验原理
将待分离的样品进行一定的稀释,使微生物的细胞(或孢子)尽量呈分散状态,选用有针对性的培养基,在不同温度、通风等条件下培养,让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养,还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求
样品来源
分离对象
分离方法
稀释度
培养基名称
培养温度
/℃
培养时间/d
土样
细菌
稀释分离
10-5,10-6,10-7
牛肉膏蛋白胨
30~37
1~2
土样
放线菌
稀释分离
10-3,10-4,10-5
高氏1号
28
5~7
土样
霉菌
稀释分离
10-2,10-3,10-4
马丁氏琼脂
28~30
3~5
面肥
或土样
酵母菌
稀释分离
10-4,10-5,10-6
马铃薯葡萄糖
28~30
2~3
细菌分离平板
细菌单菌落
划线分离
10-2
牛肉膏蛋白胨
30~37
1~2
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
三、实验材料
1. 菌源土样
2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基,马丁氏培养基,高氏合成1号培养基,马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面),见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶,每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用),内装10粒玻璃珠。 mL无菌水试管(每人5~7支)。
4. 其他物品无菌培养皿,无菌移液管,无菌玻璃涂棒(刮刀),称量纸,药勺,橡皮头,10%酚溶液。
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
(一)系列稀释平板法
1. 取土样
选定取样点,按对角交叉(五点法)取样。先除去表层约2cm的土壤,将铲子插入土中数次,然后取2~10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀,除去碎石、植物残根等杂物,装入已灭过菌的牛皮纸袋内,封好袋口,并记录取样地点、环境及日期。同时取10~15g,称重后经105℃烘干8h,置干燥器中冷却后再次称重,计算含水量。土样采集后应及时分离,凡不能立即分离的样品,应保存在低温、干燥条件下,尽量减少其中菌种的变化。
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
2. 制备土壤稀释液
称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中,充分振荡,此即为10-2浓度的菌悬液。,用移液管吹吸三次,摇匀,此即为10-3浓度。同样方法,依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行,稀释过程见图2-1。
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
图2-1 稀释分离过程示意图
实验2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌 及霉菌的分离与纯化
3. 接种
分离不同的微生物类群采用不同的稀释度,参考表2-1进行选择。
从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中(每个稀释度每种做2-3个培养皿,并注意做好浓度及培养基种类标记),同时做空白对照,倒入熔化后冷却至45℃~50℃左右的相应培养基,见图2-2,轻轻地摇动并旋转平皿,使菌悬液与培养基混合均匀,水平静置待凝,倒置于相应温度的培养箱中培养,2~5天后,观察菌落情况及计数。