文档介绍：基因工程原理
牛颜冰
niuniugood@
《基因工程原理》
第一章导论
第二章基因操作的工具酶
第三章基因克隆的载体
第四章基因克隆的策略
第五章克隆基因的表达
第六章基因工程的基本技术
第二章基因操作的工具酶
第一节限制性核酸内切酶及其应用
第二节 DNA连接酶及其应用
第三节 DNA聚合酶及其应用
第四节修饰性工具酶
ic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the ic engineer.
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应
第一节限制性核酸内切酶及其应用
50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象
(B)
(K)
大肠杆菌B
大肠杆菌K
1
1
4×10 — 4
10 — 4
成斑率
efficiency of plating
限制—修饰的酶学假说
(B)
(B)
酶切位点
不被修饰
噬菌体DNA
被切割
酶切位点
被修饰
Methylation
基因组DNA
不被切割
1968年,Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶;
1970年,Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核
酸内切酶Hind II,使得DNA分子的体外精确切割成为可能。
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应
第一节限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的概念
限制性核酸内切酶( Restriction endonucleases):是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列,并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。
限制性核酸内切酶的分类
1. 限制修饰活性
2. 内切酶的蛋白
质结构
3. 限制辅助因子
4. 切割位点
5. 特异性切割
6. 基因克隆中
I 型
单一多功能的酶
3种不同亚基
ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸
距特异性位点1000bp
不是
无用
II 型
限制酶和修饰酶分开
单一成分
Mg2+
特异性位点及其附近
是
非常有用
III 型
双功能酶
2种亚基
ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸
特异性位点3‘端24-26bp处
是
有用
限制性核酸内切酶的命名
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体
字母的略语表示酶来源的菌种名称,如大肠杆菌Escherichia
coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为
Hin;
2、用一个正体字母表示菌株的类型,比如EcoR、Hind;
3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系,则
用罗马数字标出,比如Eco R I、 Hind III。