文档介绍：第五章 PCR 技术原理
[本章摘要]
PCR 技术是通过模拟体内 DNA 复制的方式,在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。其过程与 DNA 复制一样有三个步骤:模板变性,引物与模板复性,延伸。 PCR 扩增,主要的是引物设计,引物设计需要遵循一定的原则。用于 PCR 的 DNA 聚合酶种类很多,性质各异,可以满足不同的实验需要。 PCR 技术应用广泛,可以通过 A/T 克隆、 UDG 克隆等方法介导克隆,还可以通过同源重组、 DpnI 、重叠延伸等方法介导定点诱变。反向 PCR ,反转录 PCR 在基因操作中也扮演了重要角色。 PCR 技术还广泛应用于鉴定、诊断等领域。
第一节 PCR 的基本原理

    基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的 DNA 称为模板,它可以是双链 DNA 也可是单链DNA,最后扩增得到的产物是双链状态的。引物是 DNA 复制的先锋,就象结晶过程中的晶核,引导 DNA 的合成。在 PCR 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA 聚合酶是 DNA 复制的动力,在 dNTP 等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA 链。
扩增的步骤
    首先将模板 DNA 置于 92℃-96℃,进行变性(denaturation)处理,使 dsDNA 在高温下解链成为 ssDNA ,且热变性不改变其化学性质;然后退火(annealing) ,将温度降至 37℃-72℃,使引物与模板的互补区相结合;最后,在 72℃条件下, DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3'-OH 端,合成 DNA ,这个步骤称为延伸(extension)。这三个热反应过程的重复称为一个循环,经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。图 5-1 所示是 PCR 反应前四轮示意图。
第二节  PCR 反应体系

    标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl , pH 为 -(室温),而在延伸温度(72 ℃)下,pH 值接近。缓冲液中含有一种二价阳离子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+ ,有时使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供,标准浓度为。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率,提高富含 G+C 模板的扩增效率。
(dNTP)
    脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物,标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ,即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ,终浓度一般为 200mM(即饱和浓度)。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

    在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ,即 1pmol/ml , 在 100 μl 反应体系中相当于6x1013个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段,可得到 μg 的产物,足以用于常规分析。
引物设计一般要考虑以下几个问题:
   ①长度:至少 16bp ,通常为 18-30bp ,更短的引物一般会降低扩增的特异性,但会提高扩增的有效性。
   ②引物的解链温度:两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算,即 Tm=4(G+C)+2(A+T)。对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。
    Tm=+(1g[K+])+(G+C)%-(675/N)
    N 表示引物的核苷酸数目, [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度。
   ③避免引物内部或引物之间存在互补序列(3个碱基),从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。
   ④ G+C 含量:尽量控制在 40% 至 60% 之间, 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列,以及 T 在 3' 末端的重复排列。
   ⑤引物的 3' 末端最好是 G 或 C ,但不要 GC 连排。

    模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增,104至107个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时,一般使用 1μg DNA , 相当于单拷贝基因有 3×105 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的 DNA 作模板时,要达到这么多拷贝数分别需要 10ng,1ng,1pg 和 1% 噬菌斑。
聚合酶
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