文档介绍：广州医学院
硕士学位论文
流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究
姓名:李华梅
申请学位级别:硕士
专业:儿科学
指导教师:陈福雄
2011-05
广州医学院硕士学位论文流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究
流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号
蛋白的初步研究

中文摘要
研究背景
急性白血病(Acute lekemia,AL)占小儿恶性肿瘤的首位,任何年龄均可发
病,但以学龄前期儿童多见。我国0-10岁儿童白血病的发病率为3/10万-4/10万,
严重威胁着儿童的健康。近20多年来,儿童急性白血病完全缓解(CR)率和5年
无病生存率已经得到明显的提高。儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)通过化疗CR
率已高达96-99%,5年无病生存率也达70%-80%,但是仍有约20%的患者治疗失
败。尤其是急性髓性白血病(AML)的疗效远不如ALL,儿童 AML的长期无病存活
率不足60%[1]。
白血病细胞对化疗药物耐药是治疗失败的重要原因,然而,我们对白血病细
胞内在的分子生物学特性还不是很清楚,白血病细胞增殖与耐药性是目前白血病
治疗研究的热点之一[0]。为了进一步认识白血病细胞的分子生物学特性和白血
病细胞信号通路与白血病化疗敏感性的关系,我们研究与白血病细胞生存密切相
关的信号通路,如PI3K/AKT、RAS/RAFMEK/ERK和JAK/STAT通路等,进行了
初步的研究。现在已有研究证明这些通路与白血病发生、白血病细胞增殖、抑制
细胞凋亡和引起细胞耐药相关。针对信号通路的分子靶向药物,部分已经进入临
床实验阶段。
近年来,流式细胞术应用于细胞信号通路的检测,发展出磷酸化流式细胞术
(Phospho-specific flow cytometry, phospho-flow)[0]。 Phospho-flow能从单个细
胞水平检测白血病细胞信号蛋白的激活,同时分析多个磷酸化信号蛋白之间的关
系。Phospho-flow可应用于白血病以信号通路为基础的危险分型研究、新药开发
的实验研究和分子靶向药物临床实验的药效监测,Phospho-flow具有潜在的临床
应用价值。因此,我们建立Phospho- flow检测白血病患儿白血病细胞内磷酸化
信号通路的实验方法,探讨Phospho- flow在白血病实验研究及临床应用。
P-AKT 是 PI3K/AKT 通路中AKT 的激活形式、P-ERK1/2 是
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广州医学院硕士学位论文流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究
RAS/RAF/MEK/ERK通路的的激活形式、JAK/STAT通路的P-STAT1、P-STAT3、
P-STAT5、P-STAT6,这3个通路的激活均与细胞的生存、凋亡相关,有多项研究
发现,他们还与白血病细胞的耐药有相关性。因此,我们采用Phospho-flow技术
检测初诊儿童白血病细胞磷酸化蛋白即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、
P-STAT5、P-STAT6的表达,分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERKJAK/STAT通
路与患儿危险分型、药物治疗反应之间以及急性淋巴细胞白血病(Acute
lymphoblastic leukemia ,ALL)高危分型之间的关系,探讨Phospho-flow技术的临
床应用价值。

目的

号蛋白的磷酸化流式细胞技术;

通路磷酸化蛋白的表达,了解儿童白血病细胞内磷酸化蛋白P-ERK1/2、P-AKT、
P-STAT1 、 P-STAT3 、 P-STAT5 和 P-STAT6 的表达,分析PI3K/AKT 、
RAS/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT通路与患儿危险分型、药物治疗反应之间以及
ALL高危分型之间的关系,探讨Phospho-flow技术的临床应用价值。

方法
K562 细胞株的磷酸化蛋白
(1)将 P-AKT、P-ERK1/2 表达阳性的 K562 细胞株作为阳性对照细胞,U0126
(MEK 阻滞剂)和 LY294002(PI3K 阻滞剂)阻滞的 K562 细胞作为阴性对照细
胞。
(2)细胞内磷酸化蛋白的固定:根据Sue Chow等[4]的Phospho- flow实验方
法,采用终浓度为4%的甲醛,在37℃中孵育10m