文档介绍：Western Blot 详解 Western 免疫印迹( Western Blot ) 是将蛋白质转移到膜上, 然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白, 可用相应抗体作为一抗进行检测, 对新基因的表达产物, 可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下 Western Blot 技术。 Contents : (1) 原理(2) 分类 i. 放射自显影 ii. 底物化学发光 ECL iii. 底物荧光 ECF iv. 底物 DAB 呈色(3) 主要试剂(4) 主要程序(5) 实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择 7. 参照的疑问 8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索 10. 方法的介绍 11. 结果分析(1) 原理与 Southern 或 Northern 杂交方法类似,但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳, 被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体( 例如硝酸纤维素薄膜)上, 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质, 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原, 与对应的抗体起免疫反应, 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应, 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。(2) 分类 western 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光 ECL iii. 底物荧光 ECF iv. 底物 DAB 呈色现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法, 目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL 。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单, 原理如下( 二抗用 HRP 标记): 反应底物为过氧化物+ 鲁米诺, 如遇到 HRP , 即发光, 可使胶片曝光,就可洗出条带。(3) 主要试剂 1、丙烯酰胺和 N,N’- 亚甲双丙烯酰胺, 应以温热( 以利于溶解双丙稀酰胺) 的去离子水配制含有 29%(w/v) 丙稀酰胺和 1%(w/v)N ,N’- 亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g ,N, N- 亚甲叉双丙稀酰胺 1g ,加 H2O 至 100ml 。) 储于棕色瓶, 4℃避光保存。严格核实 PH 不得超过 ,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。 2、十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v) , 1mlH2O 去离子水配制,室温保存。 3、分离胶缓冲液:-HCL(): 和 48ml1mol/LHCL 混合,加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:-HCL(): 溶于 40mlH2O 中, 用约 48ml 1mol/L HCL 调至加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保存。这两种缓冲液必须使用 Tri s 碱制备,再用 HCL 调节 PH 值,而不用。 5、 TEMED 原溶液 N,N,N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。 PH 太低时,聚合反应受到抑制。 10%(w/v) 过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数 ml ,临用前配制. 6、 SDS-PAGE 加样缓冲液: Tris 缓冲液 8ml ,甘油 , 10%SDS , 巯基乙醇 , % 溴酚蓝 , H2O 32ml 混匀备用。按 1:1 或 1:2 比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮 3min 混匀后再上样,一般为 20-25ul ,总蛋白量 100 μg。 7、 Tris- 甘氨酸电泳缓冲液: , 188g 甘氨酸, 10gSDS , 用蒸馏水溶解至 1000ml ,得 Tris- 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释 10 倍。 8、转移缓冲液: 配制 1L 转移缓冲液, 需称取甘氨酸、碱、 SDS , 并加入 200ml 甲醇,加水至总量 1L 。 9、丽春红染液储存液: 丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时上述储存液稀释 10 倍即成丽春红