文档介绍：病毒相同,为疞浼咏鞤乒绷’渲墟栈虮嗦氩《镜暮诵牡鞍祝琾慢病毒载体介导转基因小鼠制备技术研究木摘要纪托駐。其中调节基因缸土姆直鸨嗦肓礁龇词郊せ钜蜃铀纅蛋白和镜鞍祝纅入到染色体上。慢病毒属逆转录病毒的亚科,具有逆转录病毒的基本结构选,和煌υ谟诼《景个辅助基因,杂、,√鸷个调节基因一、研究目的及背景转基因动物模型是联系分子、细胞水平研究和整体动物研究的桥梁。自年⋯首次采用原核显微注射开展动物转基因研究以来,已有十多种主要的转基因动物制作方法,如原核显微注射法、逆转录病毒侵染法、精子介导法、胚胎干细胞法,体细胞核移植法等。这些转基因动物制备方法各有优缺点:原核显微注射法制作转基因动物闲实停衔坏悴欢ǎ际跄讯却螅τ糜诟叩炔溉槎锸钡男屎艿停精子介导基因转移技术技术存在随机性和不确定性;胚胎干细胞法制备的转基因首建动物一般是嵌合体,不易实现外源基因的自然繁殖传代,且建立干细胞系的难度较大,应用受到限制;体细胞核移植法操作难度大,且外源基因的表达与否受整合位点附近基因的影响。相对而言,慢病毒侵染法在可操作性、胚胎发育率、移植妊娠率、目的基因整合效率、目的基因表达率、阳性个体的选育等方面比上述几种技术均有显著的优势。年,】首次用逆转录病毒感染胚胎制作转基因动物获得成功。逆转录病毒的胂赴螅孀B汲蒁前病毒,利用逆转录病毒的整合酶及其特异的末端核苷酸序列,将安《菊系饺旧迳希佣湫耐庠椿蛞膊蛋白在慢病毒基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用,鞍自蚩纱偈蛊浠虻表达由早期向晚期转化。安《镜闹饕=峁够蚣捌渑帕行问接肫渌孀B基因编码病毒复制所需的酶类,,基因编码病毒的包膜糖蛋白,踊蛟虮嗦肭懈畹白前体所需的蛋白酶。慢病毒载体,广泛用于体外细胞的转染和基因治疗的研究。目前用成功转染的细胞有神经细胞、视网膜感光细胞、肌细胞,第三军医大学硕士学位论文狙芯炕竦霉易匀豢蒲Щ恢厍焓凶匀豢蒲Щ鸺苹手钅,
壬龇虹效应。。要实现表达如此短的一段鼬姒片段,转基因载体的长度可以控制在很合适的范肝细胞、早期胚胎细胞等,用制作的转基因动物有小鼠、大鼠、猪,牛等。的优势在于:转染效率高,能够感染分裂期和静息期细胞,能转染多种组织;整合到宿主基因组中的目的基因能持久稳定的表达,不易形成嵌合体,一般能自然繁殖传代:经改构后,不在宿主细胞内增殖,也不会导致寄主细胞的死亡,免疫源性极小,生物安全性高。用于转基因动物模型制备也有一定的局限性:一是制备难度较大,不易获得高滴度、高纯度的病毒;ⅲ谒拗骰蜃樯系恼弦话闶撬婊模赡芨扇挪入位点及其附近基因表达;虽可通过控制病毒的滴度来调节转入基因的拷贝数,但是不容易实现整合拷贝数的精确控制;携带目的基因的容量较小毙枰2迦大片段保嵯拗浦票窵牡味龋安《綝在宿主基因上是多位点随机整合,当转基因启动子的表达需要多拷贝时应选择原核显微注射法。技术与岷鲜褂茫梢韵喽匀菀椎卦谧;蚨锵赴卸蕴囟ɑ蚴迪ü桶谢騧罨涠砸汲聊春咸到鈓蜃璋围内~,对插入目的基因容量有限腖此凳掷硐耄蚨鳯谥票扇抛;蚨锬P蜕系挠攀聘用飨浴本实验通过慢病毒介导高效地研制了转基因小鼠,建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系,并利用该技术制备了树突状细胞珼异性干扰虮泶锏腞干扰小鼠模型,进一步验证了利用该技术体系在小鼠树突状细胞实现对特定基因进行抑制的可行性与有效性。二、研究内容及结果在第一部分,本课题开展了通过慢病毒载体介导、结合卵周隙显微注射、以为报告基因的转基因小鼠制备方法学研究,探讨了通过卵周隙显微注射重组慢病毒对胚胎发育的影响,以及通过此法研制转基因小鼠的效率。结果:建立并优化了三质粒慢病毒包装系统,获得了滴度达到/以上的注射用重组慢病毒;通过卵周隙显微注射,胚胎的赴蚜崖饰%,与无处理组无显著差异;在赴期,每一视野下胚胎阳性率/得靼暗牟《境晒Σ⒏咝У刈H拘∈胚胎;将注射后发育至赴呐咛ネü渎压芎共看┐桃浦卜ㄒ浦埠螅僭心甘妊娠率为./艽蟪潭壬媳苊饬松〔恳浦卜ǔ鲅5贾碌呐咛ゴ婊盥氏陆担高了移植成功率;首建鼠阳性率为./、转基因小鼠的总体研制效率;蛐∈笫⑸渑咛ナ为%,说明卵周隙显微注射对胚胎幌赴第三军医大学硕士学位论文
特异性抑制虻钠霭雀扇判∈竽P停橹ち烁米;蚣际跆逑档脑谥票缸;疉亩远干扰策略、利用第《窘榈嫉淖;蚨锛际跤肫銮鵬技术相结合,首次建立了在小鼠表达产物砌呵甊可在小鼠树突状细胞“裂率几乎无影响,表明慢病毒载体辅以卵周隙显微注射法制作转基因动物高效可行;将阳性首建小鼠采用近交方法建系,至第鍪来ü夤鄄旆⑾殖呕竦玫呐胎全部呈阳性,且新生鼠阳性率为ィ得鱡蚩梢酝ü窒荡ù在第二部分,采用了基于一部分建立的转基因平台制作转基因小鼠模型。,报告基因为。由于胁⒚挥杏ü馑孛富颍菇嗽贒中特异性干扰荧光素酶基因的载体质粒瓼作为对照。结果:甊和、肌组