文档介绍：第二军医大学
硕士学位论文
成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究
姓名:叶丽伟
申请学位级别:硕士
专业:细胞生物学
指导教师:胡以平
2011-05
成熟 T 淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究
摘要
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)是利用病毒载体将
特定转录因子组合转入分化细胞,使其重编程为类似胚胎干细胞的一类细胞。它不仅
具有自我更新和多向分化潜能,而且在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状
态、类胚体和畸形瘤生成能力等方面都与胚胎干细胞相似。该技术是 2006 年由
Yamanaka 将重组有 Oct3/4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 四个转录因子基因的病毒载体引入
小鼠成纤维细胞,并成功诱导其重编程而最先创建的。在随后的研究中,如何选用来
源便捷、数目充足的成熟体细胞为重编程的靶细胞,成为 iPS 研究的热点之一。而具
备上述选材条件的成熟 T 淋巴细胞,却存在体外成活时间短和病毒转导效率极低等技
术难题。
慢病毒(lentivirus)载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)为基础发展起来
的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感
染能力。在相关的细胞实验操作中,对于一些按常规方法难以转入甚至无法转入的细
胞,如原代细胞、干细胞等未分化细胞,通过慢病毒介导的方法能够大大提高基因的
转导效率,而且使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率也明显增加,这为报告基因
在细胞内的高效瞬时表达研究提供了有利途径。
本研究建立了适合小鼠成熟活化 T 淋巴细胞体外长时间培养,以及慢病毒转导的
技术平台,获得的主要研究结果如下:
1、成熟 T 淋巴细胞的增殖与活化。采用 Ficoll 梯度离心法分离小鼠单个核细胞,
分别用刀豆蛋白 A(ConA)和 anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28 等方法活化成熟 T
淋巴细胞,并利用流式细胞法检测 T 细胞表面 CD4+CD44high 等活化标志;羧基荧光素
双乙酸盐-琥珀酰亚胺酯(CFSE)示踪法检测活化细胞的增殖分裂状况。
结果显示:可从 3 月龄的雌性 Balb/c 小鼠(SPF 级)的脾脏中分离到∼2×107 单
个核细胞;96 孔“U”型板经 anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28(终浓度分别为 2
μg/mL、4 μg/mL)包被后,可使 ×105 个细胞/孔在第三天(D3)迅速增殖至 ×106
个细胞/孔,经过 anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28 刺激活化的 CD4+CD44high T淋
巴细胞占活细胞总数的(±)%,且 CFSE 强阳性细胞由原来(±)%降至
(±)%;该活化 T 淋巴细胞在含 IL-2(终浓度 30 ng/mL)CTL 培养基中可维
持生长(D14 细胞数为 ×106/孔);而经 ConA 刺激激活的 T 淋巴细胞在 D7 才能达
到最高值 ×106 个细胞/孔,且随着培养时间延长,细胞凋亡增多,直至完全死亡。
实验评价了小鼠成熟 T 淋巴细胞在体外培养条件下能否保持长期的增殖与活化状况
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的可行性,为下一步进行 GFP 重组慢病毒转导奠定基础。
2、慢病毒的包装及对成熟 T 淋巴细胞的转染效率。采用脂质体将 GFP 重组慢病
毒质粒转染到包装细胞 293T 中,48 小时后收集细胞上清液,进一步用超速离心的方
法纯化 GFP 重组慢病毒,转导LEPC 细胞 D2 后,采用流式细胞法检测其转染效率和病
毒滴度。最后将纯化的 GFP 重组慢病毒分别按 MOI=1,5,10 等不同滴度,转染经
anti-mouse CD3 & anti-mouse CD28 刺激激活的 T 淋巴细胞,并观测 GFP 重组慢病
毒对 T 淋巴细胞的转染效率。
结果显示:经脂质体法将 GFP 重组慢病毒质粒转染到包装细胞 293T,在 48 小时
后,293T 全部带有绿色荧光,转染效率为 95%以上。未纯化的 GFP 重组慢病毒颗粒(500
μL 病毒/孔)转导 LEPC 细胞,经流式细胞仪分析 GFP 的阳性率为(±)%;而
经超离纯化浓缩 10 倍的重组慢病毒组(50 μL 病毒/孔),其 GFP 阳性率仍达(±
)%。纯化后的 GFP 重组慢病毒转染经 anti-mouse CD3 & ant