文档介绍：一、蛋白浓度的直接测定( UV法) 这种方法是在 280nm 波长,直接测试蛋白。选择 Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如 DNA 的干扰; 另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。(1)简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [*OD280-*OD260 ]* Dilution factor (2)精确计算通过计算 OD280/OD260 的比值,然后查表得到校正因子 F,再通过如下公式计算最终结果: 蛋白质浓度(mg/ml) =F *(1/d) *OD 280 *D 其中 d为测定 OD值比色杯的厚度 D为溶液的稀释倍数二. 紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】。。【实验原理】大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸(酪氨酸和色氨酸)残基,使蛋白质在 280nm 的紫外光区产生最大吸收,并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比,利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定 - 的蛋白质溶液,此操作简便,测定迅速,不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定。因此,此法在蛋白质的制备中广泛应用。【实验材料】 1. 实验器材试管及试管架; 50毫升容量瓶 2只;移液管;紫外分光光度计。 2. 实验试剂(1) 标准蛋白质溶液:精确配制 2mg / ml的酪蛋白溶液。(2) 样品溶液:配制约的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。【实验操作】 1. 绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂: 管号 0123456 试剂标准蛋白质溶液( ml) 蒸馏水( ml) 蛋白质浓度( mg/ml ) 试剂加完后摇匀,在紫外分光光度计上,于 280n m处以 0号管为对照,分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标,标准蛋白溶液浓度为横座标,绘制出标准曲线。 2. 测定未知样品取样品溶液 4毫升,加蒸馏水 4ml 混匀,在 280nm 下测定其光密度值。【实验结果】根据样品溶液的光密度值,在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。三. 双缩脲法( Biuret 法) 实验原理双缩脲( NH3CONHCONH3 )是两个分子脲经 180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 9 L'BP n! 试剂与器材试剂:' T! `$ d3 V, J%A (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白( BSA )或标准酪蛋白,配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 %NaCl 配制,酪蛋白用 NaOH 配制。 1 ^) ^+ }: ~1 L2~ N" ?6C (2)双缩脲试剂:称以克硫酸铜( CuSO4 · 5H2O )和克酒石酸钾钠( KNaC4H4O6 · 4H2O ),用 500 毫升水溶解,在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液,用水稀释到 1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。器材: ) m, W4 G% C9 ~, w)O )q A4 S8 X9 t,n 15支。