文档介绍：中山大学
博士学位论文
日本血吸虫乳酸脱氢酶的功能研究
姓名:吕刚
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:余新炳
20060501
日本血吸虫乳酸脱氢酶的功能研究摘要血吸虫病且恢质澜缧苑植嫉娜耸薰不夹约纳娌湮:π越龃斡谂奔玻澜缥郎橹却√乇鸸婊淞形H蚍段е氐惴乐蔚种卮笕却≈弧H毡狙N娌是我国当前危害最严重的人兽共患寄生虫病,主要流行于长江流域及以南地区的鱿兀蜓N娌〔∪思案腥菊撸蛉丝谑艿窖N娌〉威胁,是我国政府高度重视的公共卫生问题。日本血吸虫防治研究一直是学术界关注的热点,尤其是我国实施和接近完成的日本血吸虫基因组计划,为新型抗血吸虫药物和疫苗研究开辟了广阔的空间。吡喹酮琍⑶噍锼乩嘁┪锸悄壳盎е瘟萍盎гし血吸虫病的关键药物,在血吸虫病防治中起重要的作用。已有血吸虫对吡喹酮有耐药性或敏感性降低的报道。但遗憾的是,吡喹酮及青蒿素类药物的分子作用机制目前尚未完全阐明,目前尚无有效的替代药物,为应对未来可能出现的耐药性问题带来隐患。在血吸虫病诊断方面,传统的病原学检查仍是诊断的金标准,免疫学诊断主要利用成虫抗原俺媛逊置诳乖来检测相应抗体,不能对现症感染和药物疗效做出准确的判断,只能作为一种临床的辅助诊断手段和流行病学调查工具。寻找高度敏感、特异的诊断抗原以及建立经济、可靠、能及考核疗效的免疫诊断方法依然是血吸虫病防治研究的目标之一。血吸虫疫苗研究进展缓慢,目前尚无成功的疫苗问世。要研制理想的血吸虫病免疫诊断试剂盒和疫苗,必须对其抗原特性以及虫体对宿主免疫系统的调控和逃避机制进行深入的了解,这有赖于对日本血吸虫基因组和基因功能的深入研究。我国率先实施了日本血吸虫基因组计划,已基本完成,开始进入功能基因组研究阶段,为筛选更理想的血吸虫病诊断抗原和疫苗抗原奠定了坚实的基础。博士学位论文
甋基因的生物信息学分析及其克隆、表达、纯化后基因组时代主要的研究策略是发展和完善生物信息学技术,对基因组数据进行分析和归纳,对基因及其编码蛋白质的结构和功能进行理论预测,并通过实验研究加以证实,其目标就是研制出更好的抗血吸虫药物、疫苗和诊断试剂。当前关注的热点是在已获得的日本血吸虫基因组数据库中寻找那些位于虫体表面、参与虫体重要的营养、能量代谢及免疫应答过程的基因,评价它们在药物筛选、免疫诊断和疫苗研究方面的应用潜力。无氧糖酵解是血吸虫能量代谢的主要途径,糖酵解途径相关酶与血吸虫的生存密切相关,可能是潜在的药物作用靶分子。虫体药物实验已证明吡喹酮、┪锏淖饔冒斜辏薹肿铀街ぞ荨本研究选择日本血吸虫作为研究对象,在本实验室已获得日本血吸虫全长序列的基础上,利用生物信息学技术对该基因及其编码氨基酸序列进行结构与功能的预测;对性表达获得有生物学活性的可溶性重组蛋白,并对纯化重组蛋白的主要酶动力学参数进行了测定;在此基础上,对棉子酚、吡喹酮、蒿甲醚、血红素等药物对重组挠跋旖辛搜芯浚云诹私膺拎!⑤锛酌训纫┪锏姆肿作用机制,筛选新的抗血吸虫药物。最后,结合生物信息学预测结果,对重组蛋白免疫学功能进行了初步研究,试图了解其在免疫诊断及疫苗研究中的应用价值。方法应用在线分析及生物信息学软件对肫渌镏忠阎狶序列进行同源性比对,并对耐仄私峁埂⒖乖砦弧⒎肿咏叵狄约暗鞍字三级结构等进行分析。应用分子克隆技术构建原核表达质粒,实现其在大肠杆菌的可溶性表达,用亲和层析技术纯化目的蛋白,狿癢鉴定。结果ǔ龊塑账幔嗦肭挥,编码被幔砺鄯肿恿课鹊绲.。博士学位论文日本血吸虫乳酸脱氢酶的功能研究.
种人胁狝、一⒁籆耐葱苑直鹗ァァァ属同一起源,其进化地位较秀丽杆线虫及果蝇高,而与协狟、一进化关系接近,,哂衅渌同源性最高为%,与阴道毛滴虫同源性最低为%,,分别是、,推测该蛋白可能是膜蛋白,其嗽谀つ冢珻端在膜外,,可能是其主要的抗原表位。该区域与嗤虻陌被嵝蛄完全相同,与秀丽杆线虫、果蝇、家鼠⒎侵拮ν躄/及人相应区域有个氨基酸残基的差异,而与恶性疟原虫、弓形虫及嗤虻陌被嵝蛄胁钜烀飨裕乇鹗荘、赜械插入片段『梦挥诟貌课唬形镏諰高度保守的关键催化位点ò彼位于此区域,该区域又是底物丙酮酸的结合区。.峁沟姆肿咏<胺治鼋峁砻鳎抗原表位区域在蛋白表面形成一环状结构,该结构又是底物丙酮酸结合部位及关键催化位点精氨酸所在位置。另外两个关键催化位点天冬氨酸及组氨酸也位于该环状结构附近。.菇⊿#迪至嗽丝扇苄员泶锛澳康蛋白的纯化,蚖结果显示在分子量τ邢嘤的表达条带,证明可溶性表达成功,并获得纯度较高的目的蛋白。