文档介绍：实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程 一、RNA 的提取(详见RNA 提取及反转录) 不同组织样本的RNA 提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR 对RNA 样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA 的降解,保持RNA 的完整性。 在总RNA 的提取过程中,注意避免mRNA 的断裂;取2ug 进行RNA 的甲醛变性胶电泳检测,如果存在DNA 污染时,要用DNase I 进行消化(因为在处理过程中RNA 极易降解,建议体系中加入适量RNA 酶抑制剂)。 二、DNase I 消化样品 RNA 中的 DNA 用DNase I 消化 DNA 组份 加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC 处理H2O 至 100ul 混匀,37℃ 90min 三、RNA 琼脂糖凝胶电泳 %的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制: 1) 放入三角瓶中, 的10×MOPS 的 DEPC 水,放微波炉里溶化。 2) 待冷却到 60 摄氏度左右时,加入1ml 甲醛,摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。 样品4 μl,加入6×RNA 电泳上样缓冲液2 μl 混匀,加入变性胶加样孔中。 电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察,照相保存。 电泳结果如下图所示。可见28S 和18S 两条明亮条带,无DNA 条带污染。 反转录为cDNA 反转录程序(以MBI 的M-MLV 为例) 组份加量(20ul 体系) 加量(40ul 体系) 模板(RNA) ~ 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) DEPC 处理H2O 至 25ul 混匀,70℃ 5min,立即冰浴 5*buffer dNTP(10mM) RNase Inhibitor 混匀,37℃ 5min M-MLV 42℃ 60min ,70℃ 10min 反转录引物的选择与Real-Time PCR 引物设计的要求 1)随机六聚体引物: 当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板,PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 2)Oligo(dT): 是一种仅对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA 具有3'端 Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+)RNA 只占总RNA 的1-4%,故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA