文档介绍：实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
一、试验目的
.学习分光光度计的原理及操作
.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度二、基本原理
.根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱
范围包括可见光和紫外光，即包括波长在 200 - 800 nm之间的光。
.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外 /可见分光
光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于 190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm-400nni可见光区为400nm -800nni
原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从 465nm改变为 595nm，该蛋白—染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定 1pg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要 2分钟，颜色在1小时内稳定。操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定
三、试剂
.标准蛋白质溶液：
.考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：
四、操作步骤
.标准曲线的绘制：
取6只试管，分别加入浓度为0, , , , , ,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
.样品测定：
,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。
五、试验结果

标准蛋白质溶液浓度 mg/ml
0

02

C
吸光度A
0