文档介绍：实验十四考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一、目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂

新鲜绿豆芽

(1)分析天平、台式天平
(2)刻度吸管
(3)具塞试管、试管架
(4)研钵
(5)离心机、离心管
(6)烧杯、量筒
(7)微量取样器
(8)分光光度计

(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1 000μg/mL的原液。
(2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL 90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
(3)乙醇
(4)磷酸(85%)
四、操作步骤

(1)0~100μg/mL标准曲线的制作:取6支10mL干净的具塞试管,按表1取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管号
1
2
3
4
5
6
1 000μg/mL标准蛋白液(mL)
0

蒸馏水(mL)

考马斯亮蓝G-250试剂(mL)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量(μg)
0
20
40
60
80
100
OD595nm
 
 
 
 
 
 
(2)0~1 000μg/mL标准曲线的制作:另取6支10mL具塞试管,按表2取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为0~1 000μg/mL的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作
管号
7
8
9
10
11
12
1 000μg/mL标准蛋白液(mL)
0

蒸馏水(mL)

0
考马斯亮蓝G-250试剂(mL)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量(μg)
0
200
400
600
800
1 000
OD595nm
 
 
 
 
 
 