文档介绍：山东农业大学
博士学位论文
小麦盐胁迫响应基因TaACO1和 TaSTPK 的克隆与功能分析
姓名:陈冬花
申请学位级别:博士
专业:作物遗传育种
指导教师:王洪刚;夏光敏
2011-06
山东农业大学博士学位论文
小麦盐胁迫响应基因 TaACO1 和 TaSTPK 的
克隆与功能分析
中文摘要
盐害是影响农作物正常生长发育及产量形成的主要逆境因子之一,随着生态环境的
日益恶化,土壤盐渍化面积不断增加,对作物的生产造成严重危害。小麦是世界上最重
要的粮食作物之一,开展小麦耐盐机制的研究、耐盐基因的分离和耐盐新品种的选育,
对于扩大小麦种植面积、提高单位面积产量、保障粮食安全具有重要意义。
本研究在实验室前期工作积累的基础上,从山融 3 号和济南 177 盐胁迫后根部抑制
性差减 cDNA 文库基因表达谱芯片中,通过对差异基因的功能预测,发现了一些潜在的
耐盐候选基因。本实验选取在氯化钠处理后表达有大幅度下调的 TaACO1 及 TaSTPK 基
因为研究对象,对其进行了克隆、亚细胞定位、表达模式分析、异源表达和基因功能的
验证,并对两个基因转化拟南芥获得的纯合株系的生理性状进行了鉴定,明确了目的基
因的生理功能及其参与盐胁迫的逆境响应机理。取得的主要结果如下:
1、TaACO1 的克隆与功能分析
成功克隆了山融 3 号盐胁迫响应基因 TaACO1 的 ORF 序列和基因组全长序列,该
基因的 ORF 序列由 942 个碱基对组成,基因组序列由 4 个外显子和 3 个内含子构成。
从山融 3 号和济南 177 中克隆到的该基因序列是一致的,表明山融 3 号的 ACO1 基因来
源于济南 177。该基因的氨基酸序列与水稻中的一个 ACC 氧化酶基因的序列同源性高
达 80%以上,同玉米中的两个 ACC 氧化酶基因的同源性也达到了 60%以上,而与拟南
芥、西红柿中的 ACC 氧化酶基因的同源性相对较低,约为 40%左右。利用 200 mM NaCl、
100 mM H2O2 处理山融 3 号和济南 177 时,RT-PCR 的结果表明该基因呈下调表达,这
与 cDNA 芯片的数据一致,说明该基因可能参与了逆境胁迫响应;利用 100 μM ACC
处理时该基因则表现上调表达,可能原因在于 ACC 是 ACC 氧化酶的底物,过量的底
物诱导了 ACC 氧化酶的表达。利用亚细胞定位载体 TaACO1-GFP 对该基因在小麦原生
质体中进行定位发现,该基因在细胞质中有表达。利用 pET-30a 原核表达载体将该基因
在大肠杆菌 BL21(DE3)菌株中异源表达,发现重组蛋白在上清与沉淀中均有表达,
上清过镍柱纯化,纯化的重组蛋白与 ACC 氧化酶活性测定液反应后产生的气体,使用
气相色谱仪检测后发现,它们与标准乙烯气体有相同的峰值。推断 TaACO1 基因的蛋白
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小麦盐胁迫响应基因 TaACO1 和 TaSTPK 的克隆与功能分析
产物确实有 ACC 氧化酶功能,该基因应该是小麦中的一个 ACC 氧化酶基因,可以催化
ACC 产生乙烯。植物体内的乙烯含量的升高,可以促进下胚轴的伸长,利用 pSTART
构建过表达载体并转化拟南芥,筛选、鉴定并获得纯合株系,其种子在 1/2 MS 培养基
上萌发后在弱光照条件下生长 10 天左右,其下胚轴的长度明显长于空载体和野生型植
株对照,证明 TaACO1 的过量表达产生更多的乙烯促进了下胚轴的伸长。
2、TaSTPK 的克隆与功能分析
在山融 3 号和济南 177 中克隆到了一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,该基因 ORF
由 1485 个碱基对组成,山融 3 号与济南 177 中的序列有 5 个碱基对及 4 个氨基酸的差
异,该基因的基因组序列由 6 个外显子和 5 个内含子组成。利用 200 mM NaCl、100 mM
H2O2 处理山融 3 号和济南 177 后,RT-PCR 的结果表明该基因均呈下调表达,说明该基
因参与了植物逆境胁迫响应过程。亚细胞定位结果显示,TaSTPK 基因在细胞质和细胞
核中均有表达。该基因的纯合过表达拟南芥株系的种子在盐处理条件下萌发早于空载体
对照,且 100 mM NaCl 处理条件下萌发率明显高于后者,表明该基因在盐胁迫条件下
种子萌发的过程中起作用。在大肠杆菌 BL21(DE3)菌株中异源表达发现重组蛋白主
要在包涵体中表达,由于包涵体的复性非常复杂且复性的效率较低,重组蛋白的丝氨酸
/苏氨酸蛋白激酶活性未检测到。
通过对两个基因的分析,明确了其序列结构特点、胁迫条件下表达模式的变化,对
其功能进行了初