文档介绍：·中文论著摘要· (Influenza virus,简称流感病毒),属于J下粘病毒科(Orthomyxoviridae)。流感病毒呈球形,新分离的毒株则多呈丝状,其基因为分节段的负链RNA,根据病毒核衣壳蛋白(Nucleoprotein,NP)和基质蛋白(Matrix, M)的不同,可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种型别。甲型流感病毒根据病毒表面血凝素(Hemagglutinin,HA)抗原的不同分为16个HA亚型,根据神经氨酸(Neuraminidase,NA)的抗原不同,分为9个NA亚型。流感病毒的HA和NA易发生变异,变异有两种形式:抗原漂移(Antigenicdrift)和抗原转换(Antigenic shift),抗原漂移引起局部中小型流感流行;但抗原转换变异幅度大,每次变异都会导致新的亚型出现,由于人群对新亚型完全没有免疫力,每次抗原转换都曾引起世界性流感爆发流行,1918"-"1919年的大流行中,全世界至少有2000万人死于流感,自1997年以后H1N1亚型与H3N2亚型交替在人群中流行,并出现H5N1型禽流感病毒感染人的病例,对人类的健康造成很大的威胁。目前使用的疫苗只对疫苗所含型别有效,往往是通过产生血凝素抗体达到预防流感病毒感染的目的,对变异株无效。研究人员己开始考虑能否通过提高细胞免疫的方法,达到预防异型流感病毒感染的目的。哪种细胞免疫反应在抗异型流感病毒免疫中起主要作用?其机制是什么?目前无统一的结论。我们在lj{『期研究中发现,。为了探讨其机制,我们在应用IL一2后,对相关细胞因子及T淋巴细胞水平进行了检测,为开发以细胞免疫为基础的具有交叉免疫保护作用的流感病毒疫苗奠定基础。方法一、病毒滴度测定将A/FM/47(H1N1)流感病毒株的病毒储存液用PBS溶液进行10倍等比稀释(10-110。o),把各稀释液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔中,37。C 5%C02 培养箱培养,,计算鸡胚半数感染量。二、动物分组取“8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠90只,随机分为实验组和对照组,实验l组(异型免疫组):用H5N1型流感病毒免疫,H1N1型流感病毒感染;实验 2组(异型免疫加强组):用H5N1型流感病毒免疫,, 最后进行H1NI型流感病毒感染:对照1组(未免疫病毒感染对照组):未免疫, 直接感染H1N1型病毒;对照2组(): 型流感病毒;对照3组():,不感染。对照4组(空白对照组):正常饲养,不做任何处置。三、免疫动物选用H5N1型流感病毒疫苗按上述分组免疫动物,疫苗接种按说明书进行。首次免疫三周后加强免疫一次,方法剂量同上。再次免疫时,使用IL-2组的小鼠, ,连续注射0,l,2天。四、感染动物加强免疫两周后,按上述分组每只小鼠经鼻腔感染H1N1型流感病毒。正常饮食饮水饲养,感染病毒后每天准确称量小鼠体重,观察饮食饮水及精神状态。五、存活率和肺指数小鼠感染流感病毒后观察其存活情况,记录每组死亡数,计算各组存活率; 无菌解剖取小鼠全肺称重,并计算肺指数。六、细胞因子水平测定分别于感染前、感染7天后无菌解剖取小鼠全肺,按常规方法制作肺组织匀浆,.20。C保存待测。、、、IFN. 2 y含量,具体操作按试剂盒说明书进行,酶标仪测OI)450值,计算细胞因子含量(pg/m1)。七、CD4+T、CD8+T细胞水平测定(一)小鼠肺中CD4+T、CD8+T细胞水平测定分别于感染前、感染5天、7天后无菌解剖取小鼠全肺,称重后制作小鼠肺组织单细胞悬液,细胞分组,孵育抗体,用流式细胞仪检测CD4+T、CDS+T细胞的百分含量。(二)小鼠脾中CD4+T、CD8+T细胞水平测定取肺的同时取脾,制作小鼠脾单细胞悬液,方法同上,用流式细胞仪检测 CD4+T、CD8+T细胞的百分含量。结果一、,计算EID50为1 04一。二、一般情况及肺指数(一)感染H1N1流感病毒后小鼠死亡情况: 实验l组(异型免疫组)小鼠死亡4只,生存率为67%;实验2组(异型免疫加强组)小鼠全部存活;对照1组(未免疫病毒感染对照组)小鼠全部死亡。(二)肺指数: 实验1组(异型免疫组)%;实验2组(异型免疫加强组)%; 对照1组(未免疫病毒感染对照组)%;对照2组( 免疫组)%,其余各组均差异不大。三、Elisa试剂盒检测细胞因子