1 / 15
文档名称:

pcr扩增原理及过程.ppt

格式:ppt   大小:41KB   页数:15页
下载后只包含 1 个 PPT 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

pcr扩增原理及过程.ppt

上传人:相惜 2021/6/29 文件大小:41 KB

下载得到文件列表

pcr扩增原理及过程.ppt

文档介绍

文档介绍:第八章:PCR技术及应用
PCR技术是模拟体内DNA复制的的方式,在体外选择性的将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。其过程与普通DNA复制一样有三个步骤,首先是模板DNA变性,由双链状态变成单链状态;然后引物与模板结合,完成复制过程;最后在DNA聚合酶和底物存在情况下合成与模板互补的DNA。
编辑课件
1
第一节 PCR技术原理和工作方式
一、PCR的基本原理
1、基本要素和扩增原理
DNA的复制是生命活动中最基本的过程之一,PCR的基本原理离不开DNA复制的基本规律。在PCR过程中模板可以是双链DNA也可是单链DNA,最后扩增出来的是双链状态的。其中引物是DNA复制中不可缺少的。
编辑课件
2
与单纯的DNA复制不同的是,PCR扩增总是在两个引物的存在下对DNA的两条链同时进行复制,复制的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控制,使这样的DNA复制重复进行,从而得到大量的位于两个引物之间的DNA片段,即目的片段。前一轮扩增得到的DNA产物可做下一轮扩增的模板,扩增产物以几何级别递增。
编辑课件
3
2、PCR扩增的步骤
首先将模板DNA置于92~96度进行变性处理,使双链DNA在高温下解链成为单链DNA此时的温度称为解链温度Tm,且热变性不改变其化学性质;染后退火,将温度降至37~72度,使引物与模板的互补区结合,最后在72度条件下,DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’羟基端合成DNA这个步骤称为延伸。这三个热反应过程的重复性称为一个循环经过20~40个循环可扩增得到大量位于两条引物序列之间的DNA片段。
编辑课件
4
Tm (melting temperature):50%DNA分子变性时温度称为熔解温度/解链温度。
一般生理条件下,Tm在85℃ -95℃之间。影响Tm值的因素:
(G+C)含量增加,Tm值增高
溶液的离子强度高,则Tm增加(离子键的形成增多);
甲酰胺的浓度增加,则Tm下降(使碱基对间的氢键不稳定,可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失活);
若DNA组成比较单一,则变性发生在狭窄的温度范围内.
编辑课件
5
二、PCR反应体系
PCR反应需要在一定的条件下才能完成,只有
这些条件协调作用时才能达到很好的效果。
1、缓冲液
2、脱氧三磷酸核苷(dNTP)
3、引物
4、模板
5、DNA聚合酶
编辑课件
6
1、 缓冲液:
缓冲液除了提供pH缓冲能力外,还有一些辅助反应进行的成分,主要是Mg2+。 Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率,直接影响扩增的成败,最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度, -5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
2、脱氧三磷酸核苷 (dNTP)
脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物,高浓度dNTP易产生错误掺入;但浓度过低,将降低反应产物的产量。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同,如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低),就会诱发聚合酶的错误掺入作用,降低合成速度,过早终止延伸反应。
PCR中常用终浓度为200μM的dNTP
编辑课件
7
3、模板
模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA,因此模板是PCR 的关键,模板的质量是PCR 成功的先决条件,一般要有较高的纯度,最好用纯化的DNA样品,(粗品应避免混有蛋白酶、核酸酶)。另外模板的数量也会直接影响扩增的效果,一般要求含量合适,3ⅹ105分子数(1μg)(提高产量,减少非特异性扩增);
4、DNA聚合酶
PCR反应中使用的DNA聚合酶是耐高温的,在90度以上的高温下仍能有活性。也正是高温DNA聚合酶的应用才使得PCR技术得以推广。选择聚合酶要从实验的具体要求考虑,高保真的酶成本较高,只有要求严格时选用。
编辑课件
8
Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶,因为其缺少3‘到5’外切核酸酶(校正)活性,但是产量高,是目前实验室应用最多的酶。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。
(1)Taq DNA聚合酶
是目前实验室PCR中应用最多的酶。具有5’到3’合成活性和5’到3’外切酶活性,但无3’到5’外切酶活性。在95度的半衰期为40分钟。由于没有3’到5’外切酶活性,×10-5~~×10-4的错配率。
编辑课件
9
(2)TthDNA聚合酶
来自嗜热热细菌HB8在74度下进行扩增M

最近更新

二零二五版全新水田地承包合同 8页

二零二五版全新地板安装施工合同 9页

二零二五版债权债务担保合同 8页

二零二五版借款保证担保合同书 8页

二零二五版保洁员劳务合同范例-@-1 8页

二零二五版会议会务服务协议书 8页

二零二五版产品与服务合同模板 9页

二零二五版二手房贷款合同书范例 7页

二零二五版二手房买卖协议书范文 8页

二零二五版事业单位人事代理人员聘用合同书 9页

二零二五版个人简单租房合同范例 7页

二零二五版个人房屋买卖合同书范例 8页

二零二五版专利权转让服务合同 8页

二零二五版XX污水处理项目技术服务合同 9页

二零二五版ktv租赁合同注意事项 8页

2025年职场个人求职信七篇范文 12页

2025年职员手写辞职申请书(精选5篇) 8页

二零二五烟台二手房买卖合同 9页

二零二五漏水协议书正规范例 9页

2025年聋哑残疾人低保申请书模板 6页

2025年考研英语的考生如何分配时间备考?这四.. 3页

2025年考生忘带准考证怎么处理 4页

数据类型运算符和表达式 105页

服装面料知识大全 37页

小学道德与法治六年级下册第一单元《完善自我.. 5页

风险和机遇的识别、应对措施和评价表 7页

桥式起重机检修方案 43页

免费个人简历模板下载免费 2页

机械原理-凸轮设计(偏置直动滚子从动件盘形凸.. 16页

【东宝仲巴仁波切普巴金刚祈请简轨及传承缘起.. 15页