文档介绍：摘要小反刍兽疫是能感染家养及野生小反刍动物的一种传染性疾病。目前,小反刍兽疫呈现蔓延的趋势。2007年我国西藏地区发生小反刍兽疫疫情,这是我国首次有该疾病发生的报道,因此建立灵敏、特异、快速的检测方法对于早期发现小反刍兽疫非常重要。本研究旨在建立能快速且特异检测小反刍兽疫抗体、抗原和核酸的分子生物学和免疫学方法。利用从奥地利引进的PPRV N基因全长质粒,根据N蛋白序列的保守性分别设计5对引物进行N蛋白的分段扩增,然后将PCR扩增片段克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建了PPRv N亚单位蛋白的原核重组表达质粒。将亚单位蛋白进行纯化,并通过Western blot和ELISA进行鉴定。Westernblot分析表明除第3亚单位蛋白以外,其余亚单位蛋白均具有反应原性。ELISA 鉴定结果表明,PPRVN蛋白的B细胞表位主要位于第5亚克隆区域,即N蛋白的第Ⅳ区域。选择具有反应原性且具有PPRV特异性的亚单位蛋白pET-PPRV-N5作为包被抗原,建立间接ELISA方法用于检测血清中PPRV抗体。对所建立的间接ELISA方法的相关条件进行了优化,优化后的间接ELISA检测方法具有较高的特异性和灵敏性,%。从PPRV山羊高免血清纯化得到山羊抗PPRV的多克隆抗体(PAbs),采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,并将PAbs标记至胶体金颗粒上制备金标垫。将纯化后的重组pET-PPRV-***纤维素膜的检测线(T线)及质控线(C线),将金标垫、NC膜等组装成胶体金试纸条。所制各的胶体金试纸条可以特异性的检测PPRV抗原,检测极限达到 10ng,该方法具有良好的特异性,操作简便,可广泛应用丁基层检测。针对PPRV N基因设计一对探针,分别在5’端和3’端修饰上巯基和生物素。将巯基化的探针标记至柠檬酸钠还原法制备的纳米金颗粒上,制备纳米金核酸探针,将纳米金核酸探针与靶序列及生物索标记的探针进行杂交,杂交体系转移至亲和素包被的酶标板中,通过银染增强法进行显色。通过对银染显色时间等条件的优化建立了银染增强纳米金核酸探针检测PPRV的方法,该方法可以定量检测靶核酸,最低检测量为10 pmol/L。本研究共建立3种检测方法分别用于检测小反刍兽疫抗体、抗原及核酸,为小反刍兽疫的检测及监测建立了技术平台。关键词:小反刍兽疫病毒;亚克隆;间接ELISA;胶体金免疫层析:纳米金核酸探针 Abstract Peste despetitsruminants(PPIt),is ahigly contagious viraldiseaseaffecting domestic andwild small recent years,itspread tonew areas wag firstly outbroken in TibetofChina inJuly more necessary and criticalfor US toreinforce studies on diagnosis and control ofthe disease. Using theplasmid which plete PPR、,N gene andfivepairs ofdesigned primers according totheconservatism ofNgene,the fivesubunitswereamplified by thesubunits were cloned intopET-32a(+)expression vector subunitsprotein were resultsbyWestern blotshowed thatfourofthesubunits ofN protein had immunoreactivity with PPRV one did resultsby ELISA showed thatthemain Bcellepitopes sited words sited onW zone. The fifthsubunitproteinpET-PPRV-N5 which had strong immunoreactivity and high specificity was purified andused ascoatingantigen todeveloped aindirectELISA tOdet