文档介绍：成都医学院■生化与分子生物实验
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限制性酶刼与连接
成都医学院■生化与分子生物实验
成都医学院■生化与分子生物实验
载体（Vectors）
成都医学院■生化与分子生物实验
一种能够结合外源DNA片段形成重组DNA,并能进行自我
：质粒、噬菌体、病毒
按功能分类：克隆载体（构建基因组文库或CDNA文库）、
测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。
随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功 能的新载体，如可以容纳儿百万碱基的酵母人工染色体。
EcoRI Sall Kpnl BamHI Psi I
Hlndlll Xhol Pvull EcoRV Bglll
结构的三大要素：
・多克隆位点
•选择标记（耐药性，LacZ） •独立的复制单位
SspI
Aatfl
MCS
M130rt
MiSori
PUC118
3162 bp
AmpR
GOIE1
orl
amp
pUCHS
kb
pMB 1 ori
Hirdlll
SpM
Pstf SiK
Xb^I
s™?j Kpnl 池d EcoRI
由pUC18欢造而来，丸小3162bp o相当于農pUC18中增加了帶有M13 噬筍体DNA合成的起始与终止以及包裟进入嗤菌体颗耘所必需的顺式序列。
（二）材料
■模板DNA
■引物：APO A1-GST2（载体：pGEX七P・l）
PrimerGST6pl-AP0Al-Up:
5' GGAATTCATGGATGAACCCCCCCAGAGCC -3' EcoRI
PrimerGST6pl-APOAl-down:
55 CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3J
Sall
枯性耒端：是交错切割，结果形成两条单链未端，这 种末端的核苜酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性耒端。
如&oRI的识别顺4为:
5,……G| AATTC……3，
歹……CTTAA|G……5，
衣玖链上交错切別的佞置切割后生成
5'……G AATTC……歹
3, CTTAA G 5,
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的确 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
基因操作的基审步骤
细胞
:上一步I重播II下一步
成都医学院■生化与分子生物实验
■核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，功能犹似高等功物免疫系统，用于抗击外来 D N A侵袭。
■限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键，产生的DN A片段5，端为P, 3，端为0H。
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■玉据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为I、II、III型三大类。
■第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核昔酸顺序，在识别 位点很远的地方任意切割DNA链，切割核昔酸顺序没有专一 性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。
■第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苜酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 昔酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
■第二类（II型）限制性内切酶就是通常指的DNA限制性内 切酶.
■它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的DN A片段；
* II型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为4〜6个碱基对的反转重复顺序；
* II型内切酶切割双链DN A产生3种不同的切口一 一5,端 突出、3,端突出和平末端。
■限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目 的地对遗传物质DNA进行改造，从而极大地推动了分子生 物学的兴旺和发展。
限制性内 切酶
酶分子
识别位点
切割位点