文档介绍：发酵工艺及设备实验报告
学院： 化学化工学院
专业：生物工程班级:1201学号：201206030133
学生姓名： 程迅
实验一摇瓶发酵法制备糖化酶
一、 实验目的
（1） 掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法
（2） 了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项
（3） 熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择
二、 实验仪器及试剂
菌种：黑曲霉
仪器：锥形瓶（500ml）、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL比色管、牛皮纸、 纱布（8层）、pH计。
药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、 玉米粉、豆饼粉、鉄皮
三、 实验原理
摇瓶发酵是实验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体发酵培养基的摇瓶 放在摇床上振荡培养，以满足微生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。 它是实验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培养工艺与发酵工艺的常用方法。
葡萄糖淀粉酶（EC3. 2. ）系统名为淀粉a -1, 4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗 称糖化酶，是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原末端 切开a-1,4键，也能切开a-1,3键和a-1, 6键，产生葡萄糖。
糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原末端开始，分解a -1, 4- 葡萄糖昔键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次 碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。
四、 实验步骤
1 •培养步骤
1种子培养基制备及灭菌
将新鲜土豆去皮切块，称取200^300 g 土豆块放入500 mL烧杯中，加入一 定量水，在电炉上煮沸至土豆块熟透，用120目纱布过滤，滤渣反复用一定量水 清洗、过滤2次，合并各次滤液且定容至1000 mL即得土豆汁。取一定体积的土 豆汁，在其中加入
5%的蔗糖，溶解摇匀并调pH至5. 5,即得种子培养基。将适 量种子培养基倒入锥形瓶（250ml）,用纱布塞塞住管口，并用牛皮纸包扎，置灭 菌锅中，于121°C下灭菌30min。待灭菌完毕，冷却取出。
2发酵培养基制备及灭菌
取6只500mL摇瓶，分别按装液量100、200、300mL配制培养基（玉米粉 6%、豆饼粉2%、鉄皮1%）,加水后稍微摇动，使原料湿润，浸入水中。用8层纱 布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，于121°C下灭菌30min。
：将已生长好的菌种，在无菌条件下，按照10%的接 量（8%-12%）接种到发酵培养基上。
：将摇瓶固定在摇床上，培养温度为3VC,转速为 120r/min,培养时间96h。显微镜观察菌丝形态，用试纸测发酵液pH,测定酶活 力。摇瓶培养时观察各种摇瓶机的结构。
1待测酶液的制备：
精确吸取液体酶1. OOmL,先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研， 将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，最后全部移入容量瓶 中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100~250u/mL范围内），摇匀。通过4 层纱布过滤，滤液供测定用。
2酶活力测定：
于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25mL及缓冲液5mL, 摇匀后，于40°C恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL, 立刻摇匀，在此温度下准确反应30min,立刻各加入氢氧化钠溶液0. 2mL,摇匀， 将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。吸取上述反应液 与空白液各5mL,分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10mL,再加氢氧化钠溶液 15mL,摇匀塞紧，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2mL,立即用硫代硫酸 钠标准液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。
3酶活力计算：
样品酶活力（u/g或u/mL） =579. 9X （A-B）cXn式中：A与B分别为空白、 样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL； c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度， mol/L； n为稀释倍数。
五、数据分析
比较不同装液量下的菌体形态特征、酶活力，将结果填入下表：
装液量/mL
指标
100
200
300
酶活力
420u/mL
510u/mL
570u/mL
PH
菌体特征
出现球状的白色的菌丝团，
瓶壁上出现黑丝的葩子和菌丝
六、结论
1•不同的装液量对酶活力的影响是随着装液量的增加呈现上升的趋势，但是 酶活力变化不大，并且酶活力不高，与其他组数据相比接种量跟酶活力关 2•菌体特征在锥形瓶的瓶壁上出现白色的菌丝，在培养基中也出现了丝球
3•菌种新陈代谢的旺盛二氧化碳的释放增加，使pH值逐