文档介绍：西南农业大学
硕士学位论文
猪抗菌多肽(Defensin)基因片段的PCR扩增和克隆研究
姓名:胡宗利
申请学位级别:硕士
专业:农产品贮藏与加工
指导教师:李洪军;魏泓
20000401
猪抗菌多肽籲基因片段的┰龊涂寺⊙芯摘要猪防御素基因可能与人防御素基因的同源性不高。—、一,防御索是近年来发现的广泛存在于动物和植物体内的~类阳离子抗菌多肽,由于其广谱高效的杀菌活性,在食品工业中,可以开发成天然食品防腐剂,解决食品保质期短的问题。因此,开展对防御素的研究开发,具有巨大的经济日前,对防御素基因的研究途径有很多种,本实验采用了基因组增法,利用此方法可以发现生物体内的防御素新基因,制备防御素同源探针‘,进行防御索基因结构和功能研究。本实验基于防御素基因在物种间具有同源性,根据已报道的几种哺乳动物防御素基因序列,设计并合成四对引物,采用结果如下:⒏菖一防御素序列同源区设计的引物对谟呕跫拢州小型香猪基因组┰龀隽教醮惶踉,一条约峁表明猪防御素基因与牛环烙鼗蛴型葱裕铱赡艽嬖谄分旨洳钜臁出一条稍大于的带,表明中国三种小型香猪基因组中都分布有猪防御⒕璓和酶切分析验证,回收的约さ腜产物晒地克隆到。质粒上,为猪防御素同源探针的制备、猪防御素基因文库的筛选和猪防御素基因的体外表达提供了重要的实验材料。的引物列鸵锒訠,在多种┰鎏跫露嘉蘩┰霾铮媒峁崾效益和社会效益。际酰又砘蜃橹欣┰龀鋈鯠片段,并将其中~个片段克隆测序。西双版纳猪系基因组┰龀鲈片段,广西巴马小型香猪和贵⒏葜矸烙豍一序列两端设计的引物对璓扩增⒍钥寺∑蜳猯进行了序列分析。⒏萑朔烙豀一一一腸蛄型辞杓关键词:猪防御素基因┰隹寺素基因猯。国家重点基础研究发展规划项目⒐摇熬盼濉敝氐憧萍脊ス叵钅、国家自然科学基金重点项目,面上项目及重庆市攻关项目资助。——!、,
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抗菌活陛肽~防御素的研究进展文献综述烙氐姆植离子多肽,分子量为笥遥肿又泻鯟残基,并形成自然界中各类生物物种都具备一套有效的生存防御机制以适应外界环境。近来在植物、被囊动物、昆虫、鱼、两栖动物和哺乳动物中发现了⋯组具有抗菌作用的多肽,称之为抗菌肽。它们参与了抵抗微生物侵害的最初宿主防御活动,是内源免疫体系成分。现己从动物和植物中分离纯化出鲆陨系抗菌肽【啊8萜浣峁固卣鳎咕目杀环治<咐郲烙鼐褪瞧渲幸淮类。防御素最早是从兔的肺泡巨噬细胞中分离出来的【】,以后又从很多哺乳动物中性粒细胞‘⋯、小肠细胞”“、昆虫血淋巴液】、昆虫前中肠脚】、植物种子””、叶片【茸橹蟹掷氪炕隼础7烙厥歉缓ò彼岵谢难对分子内二硫键,具有稳定的分子结构和广谱抗菌活性。根据分子结构特征和来源的不同,防御素可分成四类:环烙亍烙亍⒗コ娣烙睾椭参防御索。本文就这四类防御素的分布、分子结构特征、生物学活性、可能的作用机制及其分子生物学特征等方面的研究概况作一综述。。防御素最早是从兔的肺泡巨噬细胞中分离出来薄浚饕4嬖谟谑戎行园紫赴氖忍烨嗫粒中盜,占人和兔中性粒细胞总蛋白的ァ】,占嗜天青颗粒蛋白总量的%,%。在人和鼠小肠细胞中也发现了大量Ⅱ.防御素的存在,如人虷、鼠薄烙刈钤缡窃谂F苷衬さ奶崛∥镏蟹⑾值模F芸咕璴。随后,扔执优V行粤O赴蟹掷氤钟隩高度周源的抗菌肽,命名为环烙薄H颂迥诩悍掷氤隽街环烙兀琱—,存在于血液自细胞和尿、颈部粘液里”,发现于牛皮癣皮肤的角质细胞”。
烙氐姆肿咏峁该类防御素首次在双翅目——麻蝇咖的幼虫血淋巴液伸的片段外,两者间无论是鄣峁褂蚧蛉远蚣诳瘴释计咨霞负醮中发现埃饕J峭ü岳コ嬷咎宓牟”浞绞如细菌感染盏疾模住昆虫血淋巴液中分泌””。昆虫防御素是昆虫中最广泛存在的诱导抗菌肽,迄今为止,仅在昆虫纲中就有大类,多种防御素被报道。这些昆虫包括双翅目郑こ崮种,毛翅目郑氤崮种,蜻蜒目諿,⑾址烙亍植物防御素该类防御素首先是在小麦和大麦谷物中被抽提得到阱刀忠逊掷氲玫降植物防御素大多来源于单子叶和双子叶植物种子。在某些植物叶片【⒙砹迨块茎雕屯愣辜灾蠭硐也分离到该类防御素。植物防御系常常定位于外缘细胞层,有的也定位于木质部、气孔细胞和气孔下腔细胞,它们所处的位置都是病原菌最先接触的部位或入口。缓环烙虰一防御索都是阳离子肽,均由个氨基酸残基组成,其中谢槌个分子内二硫键口”,通过分子内二硫键形成稳定的一片层结构,氨基末端与羧基末端的半胱氨酸之间形成的二硫键,使防御素分子呈环状。受这三股一折叠结构的影响,构成了半胱氨酸稳定的反平行式结构,并都缺少菪峁褂颌。但这两类防御素分子结构存在明显的差异:一级序列结构不同【”三