文档介绍：第四章植物病原菌分
离与纯化
二分离的准备
❿分离的准备工作
无菌室操作前保持清洁无菌
接种工作准备
>培养基的准备
❿分离材料选择
不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70%酒精浸2 一3秒
A⑵漂白粉
♦常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子
♦成分：漂白粉10g,水140ml,过滤后使用。
♦最好现配现用，放久失效，有效成分
CaCIO次***酸钙
♦好的消毒液易使有色纸褪色，且产生*** 气有强烈臭味。
♦一般3—5min,时间长短因材料不同而不同。处理种子5 — 10min,长的可达20 —30mino
A优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升***。
> (3)酒精：70%,浸很短时
间（几秒到1min）灭菌水洗。
♦较大的材料在酒精中浸或棉花
然后在火焰烧去。
幼嫩的病组织，表面用药剂消毒
时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。比较
安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水换洗八九次。
❿培养基的准备
•分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。
＞寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。
＞一种适宜于纯培养的培养基不一定适宜于分离（杂菌太多）
•有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太
长。
•植物病原菌的分离培养基，可以分为通用培养基和选择性培养基。
A通用培养基不加特殊抑制杂菌生长的物质；选择性培养基一般都要加制止杂菌生长的物质。
♦植物病原细菌分离时，要避免使用选择性培养基，因为抑制杂菌的物质一般并不杀死杂菌，而是抑制杂菌的生长，因此，从分离单个菌落繁殖得到的菌株仍可能有杂菌。
三、植物病原细菌的
分离技术
•植物病原细菌一般用稀释分离方法。
A因为在病组织中病原细菌数量巨大，分离材料中所带的杂菌又大多是细菌，用稀释培养的方法就可以使病原细菌与杂菌分开，形成分散的菌落，从而较容易获得植物病原细菌的纯培养。
•植物病原细菌分离常用的消毒方法
A漂白粉溶液处理3〜5min,然后用无菌水冲洗
A次***酸钠溶液处理2min,然后
用无菌水冲洗。
•分离培养基
A肉汁腺培养基（NA）
A马铃薯葡萄糖（或蔗糖）培养
,
❿稀释分离法
❿制备细菌悬浮液
＞取灭菌培养皿加无菌水适量，切取约4mm见方的小块病组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后，移在无菌的研钵中将病组织研碎，静置 10〜15min，使组织中的细菌进入水中置成悬浮液。
❿配制不同稀释度的细菌悬浮液
＞准备3-5个灭菌培养皿，每个皿加 200ul无菌水
＞用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混合后再从第
2个培养皿移植仁2环到第3个培养皿中，依次类推，稀释的次数根据病组织中细菌的数量而定。
❿置带菌平板
＞将熔化的琼脂培养基冷却到45°C 左右，分别倒入培养皿中，摇匀后静置冷却，凝固后在培养皿盖上标明分离材料、日期和稀释编号等。
❿挑取单菌落，转入斜面培养基。
❿平板划线分离法
＞制备细菌悬浮液
＞划线（动画）
♦用灭菌移植环蘸取以上悬浮液在表面已干的琼脂平板上画线, 先在平板的一侧顺序画3〜5条线，再将培养皿转
60。，将移植环经火焰灼烧灭菌后，从第2条线末端用相同方法再画3〜5条线。也有其他画线形式，如四分画线和放射状画线等，其目的都是使细菌分开形成分散的菌落。
＞贴标签
♦分离材料和日期等
＞培养及结果观察
•挑取单个菌落接种于斜面培
养基上，如果不纯，再移植纯
化，最后得到纯培养。
•若分离成功，琼胶平板上菌落形状和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有 1种是主要的。
•如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离。
•如果不熟悉1种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养以后接种测定其致病性，最终确定病原细菌。
•一种细菌病害一般是由一种病原细菌引起的，琼胶平板上出现几种不同类型的菌落，实质上只有一种是真正的病原细菌。