文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
H+感受器在星型胶质细胞和血管内皮细胞的表达及功能
姓名:黄超
申请学位级别:博士
专业:药理学
指导教师:陈建国
2010-05
华中科技大学博士学位论文
摘要
第一部分星型胶质细胞 ASICs 和 TRPV1 的表达和特性
目的:星型胶质细胞(astrocyte)是脑内重要的非兴奋性细胞,主要通过其细小突
触包绕血管、神经元,起支持和营养作用。脑细胞受缺血、缺氧等刺激,代谢产
生大量乳酸,后者导致微环境 H+浓度升高。升高的 H+在神经元主要激活酸敏感
离子通道 ASICs(acid-sensing ion channel)和/或 TRPV1(transient receptor potential
V1),引起钙内流、钙超载、细胞凋亡或死亡。细胞外 H+是否也能通过 ASICs
和/或 TRPV1 影响星型胶质细胞,目前还不清楚。本文旨在通过研究 ASICs 与
TRPV1 在星型胶质细胞的表达及特性,为解释星型胶质细胞在低 pH 值环境下的
高耐受性提供理论基础。
方法:采用全细胞膜片钳、钙影像、Western Blotting、RT-PCR 和组织/细胞免疫
荧光方法,观察 ASICs 和 TRPV1 在星型胶质细胞的表达及电流特性。
结果:
1. ASICs 和 TRPV1 在星型胶质细胞的表达及分布
(1) ASICs 和 TRPV1 在星型胶质细胞的表达
提取原代培养星型胶质细胞蛋白,用 western blotting 检测到 ASIC1、
ASIC2a、 ASIC3 和 TRPV1 特异性蛋白条带;提取原代培养星型胶质细胞 mRNA,
用 RT-PCR 检测到 ASIC1、ASIC2 和 ASIC3 特异性 cDNA 扩增条带;用免疫荧
光实验结合 GFAP 标记物在大脑皮质切片(10 µm)检测到星形胶质细胞 ASIC1、
ASIC2a、ASIC3 和 TRPV1 的特异性荧光。
(2) ASICs 和 TRPV1 在星型胶质细胞的分布
通过免疫荧光实验发现原代培养星型胶质细胞中 ASIC1、ASIC2a 和 ASIC3
均主要定位于核,而 TRPV1 主要定位于胞浆/胞膜。
2. 原代培养星型胶质细胞由 pH 细胞外液诱发的电流及特性
(1) 原代培养星型胶质细胞由 pH 细胞外液诱发的电流
在电压钳模式下,形成全细胞封接,破膜后将钳制电压定为-80 mV,采用多
管灌流系统,将细胞外液 pH 值由 迅速转换为 ,约 90%细胞记录到内向性
III
华中科技大学博士学位论文
TRPV1 样电流,该电流可被 TRPV1 通道特异性阻滞剂 capsazepine (CPZ,30 µM)
可逆性阻断,平均电流密度为 ± pA/pF (n=13);约 10%细胞记录到内
向性、快速激活的 ASIC 样电流。
(2) 原代培养星型胶质细胞由 pH 细胞外液诱发电流的特性
TRPV1 样电流具有外向整流特性,翻转电位约为+15 mV;电流 值为
± 。用 NMDG+替代正常外液中 Na+,TRPV1 样电流幅值显著降低,其
电流密度为 ± pA/pF (n=11, P < vs control);重新加入 Na+,TRPV1
样电流电流密度增加到 ± pA/pF (n=10, P < vs Na+-free current);无
钙外液(pH )诱发的 TRPV1 样电流密度与对照相比未见明显变化,其值为
± pA/pF (n=8, P > vs control);重新换用含 2 mM Ca2+外液后,TRPV1 样
电流密度为 ± pA/pF (n=7, P > vs Ca2+-free current)。
(3) 原代培养星型胶质细胞由 pH 细胞外液诱发的胞内钙增加
将细胞外液 pH 值由 迅速转换为 ,可诱发星型胶质细胞依赖于外钙的
2+
胞内钙增加,Δ[Ca ]i(ΔF/F)为 ± (n=20)。与同 pH 值诱发的神经元胞内
2+
钙Δ[Ca ]i(ΔF/F) ± (n=14)相比,其值显著降低(P < vs neuron)。 200
µM ASICs 非特异性阻断剂阿米洛利和 10